银杏叶提取物对百草枯致PC12细胞损伤的保护作用及机制

                           作者：康小刚，陈建宗，王百忍，徐震，李海龙，奚淑芳   

【关键词】  银杏叶提取物

    Neuroprotective effects of ginkgo biloba extract against paraquatinduced PC12 cell line damage and its mechanism

　　【Abstract】 AIM: To study the neuroprotective effect and related mechanisms of ginkgo biloba extract (EGB761) against paraquat(PQ) induced apoptosis in pheochromocytoma (PC12) cells. METHODS:  Using PQinduced PC12 cells damage as the model of Parkinsons disease in vitro, the cytotoxicity of PQ was measured by 3［4, 5dimethylthiazol2yl］2, 5diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, the impairment of PC12 cells was detected by lactate dehydrogenase (LDH) assay, the apoptosis of PC12 cells was detected by flow cytometry and the morphological change of PC12 cells was observed by caspase3 immunocytochemical staining. RESULTS:  40 mg/L EGB761 played a protective role in the damage induced by 300 μmol/L PQ for 24 h. EGB761 significantly inhibited LDH release induced by PQ in PC12 cells （0.25±0.01）(P<0.05 vs PQ group). EGB761 decreased the rate of apoptosis to 17.1% and the overexpression of caspase3 induced by PQ in PC12 cells. CONCLUSION:  EGB761 can protect cells from the necrosis and apoptosis induced by PQ, which may be related to the inhibition of caspase3 protease activation.

　　【Keywords】 ginkgo biloba extract; PC12 cells; paraquat; apoptosis; neuroprotection

　　【摘要】 目的： 探讨百草枯(PQ)对PC12细胞的损伤作用，观测银杏叶提取物（EGB761）对该损伤的保护作用并探讨其作用机制. 方法： MTT比色试验检测细胞活性；乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞损伤程度；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡；caspase3免疫细胞化学染色观察细胞凋亡. 结果： 40 mg/L EGB761对300 μmol/L PQ作用于PC12细胞24 h，具有一定的保护作用；EGB761可明显抑制PQ诱导的PC12细胞LDH的释放（0.25±0.01）(与PQ组比较，P＜0.05)；EGB761可降低PC12细胞的凋亡百分率，PQ组凋亡百分率为66.7%，使用EGB761保护后凋亡百分率降为17.1%；并可减少PQ诱导的PC12细胞caspase3过度表达. 结论： EGB761可减轻PQ诱导的PC12细胞损伤和凋亡，该作用可能与抑制caspase3蛋白酶的激活有关.

　　【关键词】银杏叶提取物；PC12细胞；百草枯；细胞凋亡；神经保护

　　0引言

　　流行病学资料显示，环境因素如除草剂、杀虫剂等与帕金森病的发生有关［1］. 二氢吡啶类除草剂百草枯（1，1′二甲基4，4′联吡啶，Paraquat, PQ）是一种常用农药，其结构与神经毒素MPTP的活性代谢产物MPP+极其相似，也具有与MPP+相类似的神经毒性［2］. 我们拟用其作为建立帕金森病体外模型的工具药物，研究银杏叶提取物（ginkgo biloba extract, EGB761）对PQ诱导的PC12细胞毒性损伤的保护作用及可能的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　EGB761（银杏叶提取物注射液，商品名金纳多，每支17.5 g/5L，批号： 2210903）为德国威玛舒培博士药厂产品；PQ、胰蛋白酶、4甲基偶氮唑蓝（MTT）, Annexin VFITC, PI为Sigma公司产品；DMEM培养液、胎牛血清、马血清为Gibco公司产品；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；兔抗鼠Caspase3抗体为北京中山公司产品. 倒置相差显微镜： 德国LEICA公司；CO2孵箱： SANYO公司；酶联免疫检测仪： DYNATECH公司；流式细胞仪：美国BECKMANCOULER公司.

　　1.2方法

　　1.2.1PC12细胞的培养PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，购于日本.  培养于100 mL/L马血清、50 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，每2～3 d 换液1次. 细胞80%融合时，用1.25 g/L胰酶消化，1∶3分瓶传代. 选取对数生长期细胞进行实验处理.

　　1.2.2药物处理根据MTT比色试验筛选的PQ浓度及作用时间和EGB761保护浓度，实验分正常对照组、损伤组、保护组. 正常对照组不加药，损伤组只加PQ，保护组加入EGB761 2 h后再加PQ，各组均在加药24 h后进行检测.

　　1.2.3MTT比色法检测细胞活性细胞以2×107/L接种于96孔板，设0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μmol/L PQ组，每组设4个复孔. 筛选出实验处理浓度. 以所选PQ浓度为终浓度处理细胞，设正常对照组及4, 8, 12, 24, 48, 72 h损伤组，每组设4个复孔. 筛选出损伤作用时间. 继之进行以下实验. 设正常对照组，损伤组及1, 10, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L EGB761保护组，保护组在加入EGB761 2 h后再加PQ，每组设4个复孔. 终止培养前4 h每孔加入MTT溶液20 μL，置37℃继续培养4 h. 弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min使蓝色结晶充分溶解，上酶标仪以波长560 nm检测每孔吸光度值（A值）.
 
　　1.2.4LDH释放的测定LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力. 药物处理后，每样品收集培养上清20 μL，加入基质缓冲液250 μL、辅酶I 50 μL，混匀，37℃水浴15 min；再加入2，4二硝基苯肼250 μL，混匀，37℃水浴15 min；加入0.4 mol/L  NaOH 2.5 mL，混匀，室温放置3 min，上酶标仪以波长440 nm检测每孔A值.

　　1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡药物处理后，用1.25 g/L胰蛋白酶0.4 g/L EDTA（1∶1）消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×108个/L. 取1 mL细胞，1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清液. 加入1 mL冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清液. 将细胞重悬浮于200 μL结合缓冲液，加入10 μL  Annexin VFITC和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min. 加入300 μL结合缓冲液，立即上机检测.

　　1.2.6Caspase3免疫细胞化学染色细胞爬片，药物处理后，以0.01 mol/L  PBS（pH 7.4）漂洗细胞3 min×2次；40 mL/L多聚甲醛固定15 min; 0.01 mol/L  PBS冲洗5 min×3次；用30 mL/L H2O2处理15 min以阻断内源性过氧化氢酶；50 mL/L正常羊血清封闭20 min；加入1∶100稀释的兔抗鼠Caspase3抗体，4℃过夜；PBS冲洗5 min×3次；加入生物素化IgG抗体，室温孵育30 min；PBS清洗5 min×3次；滴加1∶500稀释的SABC复合物，孵育30 min；PBS清洗5 min×3次；避光条件下，用DAB显色液反应10～20 min；蒸馏水洗1 min×2次；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.

　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，统计分析采用SPSS10.0统计软件进行方差分析和LSDt检验,P<0.05认为差异有显著性.

　　2结果

　　2.1EGB761拮抗PQ对PC12细胞的毒性作用

　　2.1.1PQ的浓度和作用时间与PC12细胞的损害程度相关如图1A所示，PQ的浓度为50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μmol/L孵育细胞24 h，随着浓度增加，细胞生存率逐渐下降，其中300, 400, 500, 600 μmol/L剂量组与对照组相比（对照组设为1）分别降至75.5%, 69.6%, 60.7%, 52.3%, 43.9, 25%, 17% (P<0.05). 说明PQ对PC12细胞的损伤具有浓度依赖性，浓度越大，对细胞的毒性越强. 选取PQ 300 μmol/L分别以4, 8, 12, 24, 48, 72  h作用于PC12细胞，细胞生存率与对照组相比依次为85%, 79.1%, 72.8%, 54%, 35.9%, 16.5%). 其中24, 48, 72 h与对照组相比有显著性差异（P<0.05，图1B). 说明PQ对PC12细胞的损伤也与时间有关，时间越长，损伤越大. 据此，将PQ 300 μmol/L（细胞生存率52.3%）作用24 h（细胞生存率54%）作为以下实验的干预点.

　　2.1.2EGB761对PQ诱导的PC12细胞损伤可起到保护作用不同浓度的EGB761对PQ的损伤都有保护作用，并使PC12细胞活性呈剂量依赖性的增强(图1C). 根据实验结果选取EGB761 40 mg/L为进一步实验的药物浓度.

　　2.2EGB761可抑制PQ所引起的PC12细胞损伤对照组未加任何处理因素，LDH的释放量为0.244±0.011; 300 μmol/L PQ作用PC12细胞24 h后，LDH释放量明显增多（0.27±0.02）（与正常对照组比较，P＜0.05），使用40 mg/L EGB761后可明显抑制PQ所致LDH释放量的升高（0.25±0.01）(n=5，与PQ组比较，P<0.05).

　　2.3EGB761抑制PQ诱导的PC12细胞的凋亡Annexin V和PI双标，FCM检测，可区分出凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞，准确得出细胞凋亡百分率. 正常对照组、损伤组、保护组细胞分别为6.3%, 66.7%, 17.1%. 损伤组细胞凋亡百分率明显升高，使用EGB761后，凋亡百分率明显降低（图2）.

　　2.4EGB761对PQ诱导PC12细胞表达Caspase3的影响Caspase3染色阳性反应产物呈棕黄色，均匀分布于PC12细胞胞质及突起内，着色深浅代表caspase3表达强弱. PQ作用24 h后，PC12细胞的caspase3表达明显增强，染色细胞呈深棕黄色，阳性染色分布于胞质和突起中，着色细胞数目多，细胞形态改变，突起变短（图3B）；使用EGB761后，细胞着色较浅，细胞形态结构较好（图3C）.

　　3讨论

　　大量实验证实EGB761对多种损伤引起的神经损害具有保护作用，其在神经变性性疾病方面的良好作用日益引起人们的兴趣［3］. PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，与黑质DA能神经元有许多相同的特征，被广泛用作研究黑质DA能神经元的细胞模型. 我们采用MTT比色试验，其原理为活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTT还原为蓝紫色的结晶，结晶的产量与活细胞数成正相关. 通过测定其A值来反映细胞代谢活性的强弱，表明细胞存活率降低，PQ的剂量越大，作用时间越长，A值降低越多.  而用EGB761进行干预后，A值有所升高，亦即细胞存活较之单纯PQ作用组增多. 进一步检测LDH释放量，单纯PQ损伤后LDH释放量升高，EGB761保护组则降低，证实损伤有所减轻. FCM可比较精确的反映细胞凋亡，利用Annexin V和PI双标，区分正常活细胞、凋亡细胞和死亡细胞，可获得细胞凋亡百分率，是目前较为理想的凋亡定量检测方法. 我们利用FCM得出，PQ损伤后，细胞凋亡百分率远远高于正常对照组，EGB761保护组凋亡百分率则与对照组接近. 以上实验均表明EGB761对PQ诱导的PC12细胞损伤和凋亡具有明显的保护作用.

　　在很多种哺乳动物细胞类型中，Caspase3在通过不同途径触发细胞凋亡的过程中扮演着非常重要的角色，它的激活在细胞凋亡中起着关键的作用［4］. 本实验通过免疫细胞化学染色，对PQ及EGB761干预的PC12细胞进行观测. 发现PQ作用后，Caspase3的表达增强，细胞染色较正常对照组深，着色细胞多，细胞形态改变. 使用EGB761后Caspase3的表达减弱. 上述结果表明，EGB761对PQ诱导的细胞损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是使Caspase3激活减弱，表达减少，从而减少蛋白质分解和DNA断裂，减少细胞凋亡的发生.

　　【】

　　［1］ Wesseling C, Van B, Ruepert C. Paraquat in developing countries ［J］. Int J Occup Environ Health, 2001,7:275-286.

　　［2］ Brooks CA, Chadwick HA.Gelbard. Paraquat elicited neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss ［J］. Brain Res, 1999,823:1-10.

　　［3］ Christen Y. The effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on neurodegenerative processes ［A］//Christen Y.Ginkgo biloba Extract (EGb 761) as a Neuroprotective Agent: From Basic Studies to Clinical Trials ［M］. Advances in Ginkgo Biloba Extract Research. 2001:1-13.

　　［4］ Strasser A, OConnor L, Dixit VM. Apoptosis signaling ［J］. Annu Rev Biochem, 2000,69:217-245.