EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究

【关键词】  疱疹病毒4型,人；RNA干扰；遗传载体

　　Comparative study between two construction methods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus LMP1 gene

　　【Abstract】 AIM:  To explore  the differences between two construction methods of short hairpin RNA expression vector targeting EpsteinBarr virus(EBV) latent membrane protein1(pshLMP1), so as to look for a more stable and convenient way of constructing the special shRNA vector. METHODS:  The siRNA coding sequences targeting EBVLMP1 were designed; pshLMP1 expression vector was achieved by the conventional annealing method or PCR method, and the differences of constructive strategies, construction processes and sequencing results between the two methods were analyzed. RESULTS:  pshLMP1 expression vector was  obtained by both methods but better cloning efficiency was achieved by PCR method with rare base deletion and mutation. CONCLUSION:  PCR method is a more efficient way to construct the more stable  pshLMP1 expression vector.
 
　　【Keywords】  herpesvirus 4, human; RNA interference; genetic vectors

　　【摘要】 目的： 探讨两种构建EB病毒LMP1 基因的shRNA表达载体(pshLMP1)方法的不同，寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式. 方法： 设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA 编码序列，分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1，比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同. 结果： 两种方法均能得到pshLMP1重组质粒，但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变. 结论：双链PCR法构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定，构建成功率较双链退火法高.
　　
　　【关键词】 疱疹病毒4型，人；RNA干扰；遗传载体

　　0引言

　　应用RNA干扰技术阻断EpsteinBarr病毒LMP1基因(EBVLMP1)的表达已成为鼻咽癌基因的研究方向之一. 常用的RNA干扰表达载体构建方法为双链退火法，但是由于DNA寡核苷酸单链片段长度在60~70 bp左右，化学合成的错误率高，为EBV-LMP1 基因的RNA干扰载体（pshLMP1）构建带来了不便. 因此我们设计了双链PCR法构建pshLMP1，经过实践证实双链PCR法提高了构建成功率，能够加速RNA干扰技术在鼻咽肿瘤的研究进度.

 　　1材料和方法

　　1.1材料EBVLMP1mRNA和cDNA序列从GenBank搜索. pTZU6+1载体由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室保存提供，内含有人U6启动子，能在体内转录产生RNA链，含XbaI和SalI克隆位点. DNA寡核苷酸链由上海英骏生物技术有限公司合成. Taq DNA聚合酶，dNTPs及相应buffer,限制性内切酶SalI, XbaI及相应buffer，T4连接酶均购自Takara 公司. 其余试剂均为自行配制. DNA测序工作由重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室完成.
 
　　1.2方法

　　1.2.1选择EBVLMP1基因靶位点EBVLMP1 cDNA序列由exon a, b, c三个外显子组成. 在exon c中第747920位碱基中有多个内部重复序列，长度为35 bp： GTCCTGGGACTGTTGTGACTACTGTTACCGGGTGT. 根据siRNA设计原则，选择该重复序列中第323位的21个碱基为靶位点，设计EBVLMP1基因靶向RNA干扰表达载体(pshLMP1).
 
　　1.2.2双链退火法构建pshLMP1

　　1.2.2.1按照图1的策略构建合成DNA寡核苷酸单链其中21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列.

　　图1双链退火法构建pshLMP1策略（略）

　　1.2.2.2退火，构建、鉴定pshLMP1重组质粒取等量100 mmol/L的DNA寡核苷酸单链片段混合，在退火缓冲液（100 mmol/L NaCl）中95℃加热5 min，缓慢降至室温，乙醇沉淀法纯化DNA双链，25 g/L琼脂糖电泳鉴定. 双链DNA片段与用SalI和XbaI双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否.
 
　　1.2.3双链PCR法构建pshLMP1

　　1.2.3.1按照图2的策略构建合成EBVLMP1 PCR引物其中两条引物间3′端以10个碱基互补配对（pairing bases）为佳，21nt coding sequence为拟沉默的EBVLMP1靶基因序列.

　　图2双链PCR法构建pshLMP1策略（略）

　　1.2.3.2双链PCR法扩增，纯化，鉴定以合成的寡核苷酸链同时为模板和引物，进行PCR扩增，反应体系如下： 10×Taq buffer 2.5μL, Mgcl2(25 mmol/L)2 μL, dNTPs(2.5 mmol/L each)2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各9 μL，Taq聚合酶5 U，共25 μL. 反应条件为：94℃ 1 min，94℃ 20 s， 45℃ 20 s, 72℃ 20 s；94℃ 20 s，60℃ 20 s, 72℃ 20 s，循环30次后72℃终延伸10 min，4℃保温. 乙醇沉淀法纯化PCR扩增产物，25 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，成像鉴定.
 
　　1.2.3.3酶切PCR产物及载体，构建、鉴定pshLMP1重组质粒SalI和XbaI双酶切PCR扩增产物和pTZU6+1载体，乙醇沉淀法纯化PCR酶切产物，胶回收载体酶切产物. 双酶切片段与载体进行连接，转化大肠埃希杆菌JM109，Amp抗性筛选，阳性克隆以pTZU6+1载体多克隆位点两侧的通用引物T7P和M13F（T7P: TAATACGACTCACTATAGGG M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT）进行菌液PCR鉴定，并测序鉴定插入序列正确与否.

　　2结果

　　2.1EBVLMP1靶向DNA双链寡核苷酸链鉴定双链退火法和双链PCR法得到的EBVLMP1靶向DNA双链分别进行25 g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳，证实两种方法均成功获得双链片段（图3）.

　　1: 双链退火法的一单链;   2: 双链退火法后的DNA双链;  3: DNA marker;  4: PCR法后的DNA双链; 5: PCR法单引物.

　　图3EBVLMP1靶向DNA双链的鉴定（略）

　　2.2菌液PCR初步鉴定pshLMP1重组质粒双链退火法和双链PCR法构建的pshLMP1重组质粒分别进行菌液PCR扩增，均得到了长度正确的插入片段（图4），证实两种构建法均能得到pshLMP1重组质粒.

　　1,4: pTZU6+1对照质粒; 2,5: DNA marker; 3: 双链退火法重组质粒; 6: PCR 法重组质粒.

　　图4pshLMP1重组质粒菌液PCR鉴定插入片段大小（略）

　　2.3测序鉴定双链退火法和双链PCR法构建的pshLMP1重组质粒分别进行测序比较，发现三次双链退火法构建的pshLMP1重组质粒序列均发生碱基丢失、碱基突变现象，而在双链PCR法中，pshLMP1重组质粒只经过一次构建序列测定完全正确（图5）.

　　图5测序鉴定插入片段序列（略）

　　3讨论

　　EpsteinBarr病毒（EBV）基因组编码的12种蛋白中，潜伏膜蛋白1（LMP1）是唯一能够将体外培养的人和啮齿类动物细胞转化成肿瘤细胞系的致瘤基因［1］. 应用特异性针对EBVLMP1 基因的siRNA（短双链RNA即小干扰RNA；small interferencing RNA）干预LMP1 基因表达，研究LMP1 蛋白功能和进行鼻咽癌基因是目前的研究热点［2］. 目前国内外获取siRNA片段多采用重复利用性高的载体表达法：将针对靶基因的序列克隆到含人U6或H1启动子的载体（包括真核表达载体、病毒载体、荧光表达载体）［3-4］上，然后转录出特异的短发夹状RNA(small hairpin RNA，shRNA)，shRNA 分解成为siRNA进而发挥RNA干扰作用［3］. 无论是选择何种载体进行克隆，关键的一步是必须获得序列正确的靶基因克隆片段. 目前多用双链退火法获得靶基因的siRNA编码序列［5-6］，即化学合成靶向DNA寡核苷酸单链，退火成为双链后克隆到载体上，在细胞内转录出特异的siRNA［7-8］. 但是由于单链DNA寡核苷酸片段长度过长，化学合成的错误率高，为shRNA载体构建带来了不便.
  　　
　　在前期实验中，我们多次应用传统的双链退火法构建pshLMP1载体，均能够得到重组质粒. 但是由于设计的单链DNA寡核苷酸片段长度在60~70 bp左右，测序发现化学合成片段的错误率高达25%~75%. 其中错误多为碱基丢失和碱基突变，这是因为合成长片段DNA序列时，脱氧核苷酸单体偶合成长片段的效率随着碱基数的增加而降低；并且合成引物PAGE纯化时电泳胶对长片段的分辨率比短片段低，造成割胶纯化困难，所以合成长片段引物时经常有较多的部分碱基缺失的短片段存在. 由于合成片段错误率高，双链退火法构建pshLMP1成功率并不高，成为RNA干扰抗EB病毒研究中的绊脚石. 为了提高构建成功率，我们设计了与传统PCR法不同的双链PCR构建法来构建pshLMP1. 其一，第一轮循环选用45℃为退火温度，因为两引物间只有9个碱基互补配对，自由能低，高温下不易形成双链产物，故降低退火温度以增加模板产量；其二，在其后的循环中选用60℃为退火温度，因为较高温度可以提高双链产物的特异性. 经过多次实践发现，双链PCR法能够获得插入片段序列正确的pshLMP1重组质粒，而没有一例出现碱基丢失或碱基突变. 这是因为PCR法中合成的DNA片段长度在35 bp左右，容易获得序列正确、纯度较高的片段，故而增加了构建pshLMP1的成功率. 我们设计的双链PCR构建法较传统的双链退火法更加稳定，构建成功率高，降低了EBVLMP1靶向RNA表达载体的构建难度，能够使RNA技术在EB病毒相关疾病的研究和治疗中得到广泛应用.

　　【】

　　［1］ International Agency for Research on Cancer(IARC). EpsteinBarr virus and Kaposis  Sarcoma Herpesvirus/Human Herpesvirus 8［J］. IARC Monogr Eval Carcinog Risks  Hum, 1997,70:47-57.

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