成纤维细胞生长因子10 mRNA在寻常型银屑病皮损中的表达
【关键词】 银屑病;,成纤维细胞生长因子10,;,原位杂交
Expression of fibroblast growth factor 10 mRNA in epidermal lesions of psoriasis vulgaris
【Abstract】 AIM: To study the mRNA expression of fibroblast growth factor 10(FGF10) in psoriasis vulgaris and the role of FGF10 in the pathogenesis of active psoriasis. METHODS: We detected FGF10 mRNA in normal epidermal tissues from 22 normal volunteers undergoing cosmetic surgery, uninvolved and psoriatic lesions from 22 patients by in situ hybridization. RESULTS: The expression of FGF10 mRNA in epidermis specimens was found in psoriatic lesion，uninvolved and normal epidermis with in situ hybridization. Positive staining in epidermis was distributed in the whole epidermis, and was observed in cell plasma(95%), while positive staining in normal epidermis was localized mainly at the basal cell layer(5%). Positive staining in uninvolved epidermis was located in the basal layer of epidermis (82%).Compared with the normal epidermis, the positive rate and the mean expression level of FGF10 mRNA in epidermis of psoriasis vulgaris were significantly higher than those in the normal epidermal tissues(P<0.05). CONCLUSION: The higher lever of FGF10 mRNA in the epidermis of patients with psoriasis vulgaris may play an important role in the early pathogenesis of psoriasis vulgaris.
【Keywords】 Psoriasis; Fibroblast Growth Factor 10; In situ hybridization
【摘要】目的： 研究成纤维细胞生长因子10 mRNA在寻常型银屑病皮损中的表达，探讨其在银屑病发病中的作用机制. 方法： 应用原位杂交法检测FGF10 mRNA在22例正常皮肤组织、银屑病皮损和未受累皮肤中的表达和分布. 结果： 原位杂交法检测发现，在22例正常皮肤组织、银屑病皮损和未受累皮肤表皮的全层或表皮中下层可见FGF10 mRNA表达(95%);在正常皮肤表皮的基底层或少量细胞内可见FGF10 mRNA的表达(5%);在寻常型银屑病非皮损表皮的中下层或个别细胞内可见FGF10 mRNA的表达(82%). 寻常型银屑病皮损表皮中FGF10 mRNA的表达明显高于正常对照组(P<0.05). 结论： FGF10 mRNA在银屑病发病早期阶段的表达增高可能与银屑病的早期发病有关.
【关键词】 银屑病; 成纤维细胞生长因子10 ; 原位杂交
0引言
银屑病组织病的特征性表现为角质形成细胞异常增殖、真皮浅层淋巴细胞浸润、真皮乳头毛细血管迂曲扩张. 研究表明，在一些生长因子的作用下，角质形成细胞可表现为异常增殖和分化异常，如表皮生长因子、转化生长因子α和成纤维细胞生长因子等，其中成纤维细胞生长因子10（Fibroblast growth factor 10, FGF10）对角质形成细胞的异常增殖和分化异常可能有着重要的调节作用［1］. 近年来，通过基因打靶技术揭示了FGF10 特异性受体就是Bek［2-3］,但尚不清楚FGF10及其受体是否参与了银屑病的发病过程. 我们旨在通过检测FGF10 mRNA在正常皮肤和银屑病皮损中的表达,以进一步探讨FGF10在银屑病发病机制中的可能作用.
1对象和方法
1.1对象选取我科门诊或者住院患者中临床皮疹典型并经病理证实的寻常型进行期银屑病皮损22例为实验组，同时取距该皮损约1 cm处非皮损区皮肤组织22例，其中男9例，年龄21~48（29.3±11.4）岁；女13例，年龄17~44 (30.7±7.3) 岁. 病史1 mon~33 a. 以上病例均在1 mo内未接受系统和局部的药物,无其他皮肤病及系统性疾病. 取材部位为躯干及下肢的皮损区. 另取22例在我院同期美容手术切除的正常皮肤作为对照组. 两组间性别、年龄等比较, 差异无显著性意义（P>0.05）,具有可比性.
1.2方法
1.2.1FGF10原位杂交定位原位杂交试剂盒购自武汉博士得生物公司. 所有标本均经40 g/L多聚甲醛固定,载、盖玻片均采用多聚赖氨酸处理. 为防止RNA 酶对mRNA 的降解作用,试剂的配制均使用焦磷酸二乙酯( sodium acid pyrophophate, DEPC). 简要步骤:活检组织固定包埋,切片脱蜡水化后用3 mL/L双氧水孵育10 min, DEPC水洗6 min ,胃蛋白酶K 消化30 min ,以去除阻碍探针结合的表面蛋白,PBS 和DEPC各水洗6 min ;每片加预杂交液20 μL, 42 ℃孵育2 h, 0.1 pmol/L寡核苷酸探针(探针序列：3′端地高辛标记，合成5OD, 5′ TTC TAC TGA TGT TAT CTC CAG GAT GCT GTA3′), 42℃杂交22 h,2 ×SSC 和1×SSC 液各洗15 min ,羊血清封闭液37℃孵育30 min ,生物素化抗地高辛抗体37℃孵育1 h ,辣根过氧化物酶标记的链霉素复合物37 ℃孵育30 min ,二氨基联苯胺染色,核固红复染. 阴性对照用PBS代替杂交液;替代对照用无探针杂交液代替杂交液;阳性对照为已知阳性切片.
1.2.2原位杂交切片结果的判定标准以有无蓝紫色颗粒沉着判定阳阴性. 细胞质不着色、阳性细胞数<5%为阴性（-）；细胞质着色、阳性细胞数在5%～25%之间为阳性（+）；细胞质着色、阳性细胞数在26%～75%之间为强阳性（2+）；细胞质着色、阳性细胞数>76%为极强阳性（3+）.
1.2.3原位杂交切片的Garcia半定量法判定标准在400倍光镜下进行 FGF10 mRNA定量,通过随机选择10个视野计数，每视野表皮中100个有核细胞中的阳性细胞数，取平均数为计量指标，用x±s表示.
统计学处理：计量资料用t检验，记数资料用χ2检验.
2结果
2.1FGF10 mRNA在正常皮肤及银屑病皮肤中的表达在寻常型银屑病皮损中FGF10 mRNA阳性蓝紫色颗粒主要表达于其表皮的全层或中下层,以中下层表达较明显，角质层不表达，定位于细胞质、细胞核内；在真皮的淋巴细胞、成纤维细胞质中也可见表达，在汗腺腺上皮细胞的胞质内呈强阳性表达(图1). 寻常型银屑病非皮损表皮内，FGF10 mRNA阳性蓝紫色颗粒主要表达于表皮的中下层或个别细胞的细胞质、细胞核内(图2A). 在正常皮肤中，FGF10 mRNA阳性蓝紫色颗粒主要表达于表皮的基底层或微量细胞质内(图2B).
A： 皮损；B： 真皮淋巴细胞、成纤维细胞.
图1FGF10mRNA在寻常型银屑病皮肤中的表达ISH ×400（略）
图2FGF10mRNA在寻常型银屑病非皮损中(A)和在正常皮肤中(B)的表达 ISH A×100; B×400（略）
2.3FGF10 mRNA的表达及半定量FGF10 mRNA检测情况及半定量测定有差别（表1）.
表1正常表皮、寻常型银屑病皮损表皮及非皮损表皮中FGF10 mRNA的表达及半定量结果（略）
aP<0.05 vs正常皮肤.
3讨论
FGF10亦称为角质形成细胞生长因子2（keratinocyte growth factor 2, KGF 2），因其能特异性刺激上皮细胞生长而得名，是皮肤组织形成中的重要调节因子［2］. 在FGFR中，FGFR2Ⅲb主要在上皮细胞中表达，而FGF7和FGF10能特异性地激活FGFR2Ⅲb，其中，FGF10与FGFR2Ⅲb有较高的亲和力，是特异性配体［4］. 我们发现，在银屑病真皮浅层浸润的淋巴细胞以及真皮成纤维细胞的细胞质中可见FGF10 mRNA的阳性表达，据此我们推测，真皮中的淋巴细胞、成纤维细胞释放的FGF10可能对银屑病角质形成细胞的异常增殖具有重要的作用，甚至真皮成纤维细胞通过分泌FGF10也参与其发病的过程中.
Kovacs等［5］的研究表明，银屑病皮损中激活的淋巴细胞能刺激成纤维细胞产生KGF和FGF10，其结果是维持角质形成细胞呈持续过度增殖的状态. 我们的结果与Kovacs等报道的FGF10在寻常型银屑病皮损中的检测结果基本一致. 银屑病真皮浸润的激活的淋巴细胞可分泌一些细胞因子，这些细胞因子作用于真皮成纤维细胞后，可能产生FGF10，后者可能对维持银屑病角质形成细胞呈持续过度增殖状态密切相关. 在寻常型银屑病皮损中，FGF10 mRNA阳性主要表达于其表皮的基底层或棘层,以表皮的中下层表达较明显，角质层及颗粒层不显示阳性表达. 阳性表达主要定位于细胞质、部分位于细胞核内. 在真皮浅层浸润的淋巴细胞以及成纤维细胞的胞质中也可见阳性表达，在汗腺上皮细胞中呈强阳性表达;寻常型银屑病非皮损处的表皮中,FGF10 mRNA阳性表达于表皮的中下层的细胞质内;正常皮肤FGF10 mRNA阳性仅表达于表皮的基底层细胞,且表达较弱. FGF10 mRNA检测阳性率在皮损组与正常皮肤组、非皮损组与正常皮肤组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)，而在皮损组与非皮损组，差异无统计学意义(P>0.05)，三组间半定量结果比较,差异均有统计学意义(P<0.05). FGF10 mRNA在银屑病的颗粒层、角质层中表达为阴性，在表皮的下层阳性率较高，从而对KC产生明显的促增殖作用. 因此，FGF10 mRNA在银屑病KC异常增殖中起重要的作用. FGF10 mRNA在银屑病皮损的汗腺上皮细胞中呈强阳性表达，其作用不清. 有研究发现，FGF10参与了胚胎期所有腺体的形态发生过程［6-7］. 我们发现，在寻常型银屑病真皮的淋巴细胞、成纤维细胞的胞质中可见FGF10 mRNA的阳性表达，在汗腺腺上皮细胞的胞质内呈强阳性表达. 通过对非皮损区表皮中FGF10 mRNA的检测发现,非皮损区其检测结果及半定量结果比正常皮肤区域的检测结果要高,两者相比,差异有统计学意义(P<0.05) . 因而我们推测,银屑病患者的非皮损区皮肤已处于亚健康状态,一旦受到进一步的刺激,便有可能产生银屑病皮损的改变,进而有可能引发银屑病.
【】
［1］ Emoto H, Tagashira S, Mattei MG, et al. Structure and expression of human fibroblast growth factor10［J］. J Biol Chem, 1997,272(13):23191-23194.
［2］ Itoh N. FGF as multifunctional signaling molecules: Diversity of structure and function［J］.Seikagaku, 2001,73(7):525-535.
［3］ Sakaue H, Konishi M, Ogawa W, et al. Requirement of fibrolast growth factor 10 in development of white adipose tissue［J］.Genes Dev, 2002,16(8):908-912.
［4］Uematsu F, Kan M, Wang F, et al. Ligand binding properties of binary complexes of heparin and immunoglobulinlike mod ules of FGF receptor 2［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2000,272(3):830-836.
［5］ Kovacs M, Falchi G, Cardinali S, et al. Immunohistochemical analysis of keratinocyte growth factor and fibrblast growth factor 10 expression in psoriasis［J］.Exp Dermatol, 2005,14(2):130-137.
［6］ Mailleux AA, SpencerDene B, Dillon C, et al. Role of FGF10/FGFR2b signaling during mammary gland development in the mouse embryo［J］. Development, 2002,129(1):53-55.
［7］Nie X, Luukko K, Kettunen P. FGF signalling in craniofacial development and developmental disorders［J］. Oral Dis, 2006,12(2):102-111.
