微囊藻毒素诱导细胞凋亡研究进展
1 微囊藻毒素诱导细胞凋亡
1?1 微囊藻毒素的嗜肝、嗜肾特性 流行病学及动物实验均已证实，微囊藻毒素是一种肝毒素，它具有嗜肝特性，进入机体后聚集在肝脏，在肝细胞的细胞核及线粒体中发挥损伤作用，引起肝脏炎症改变，表现为肝细胞变性、坏死，甚至肝功能衰竭。肝细胞膜上可能存在微囊藻毒素能通过的阴离子多肽通道，或者通过胆酸转运蛋白进入肝细胞，这可能是微囊藻毒素对肝细胞具有较高的亲和力的原因〔1〕。最近发现，微囊藻毒素还具有嗜肾特性。张占英等〔2〕用同位素125Ⅰ标记微囊藻毒素后，通过腹腔注射、静脉注射及口服的方式给小鼠染毒，观察微囊藻毒素在小鼠体内的分布。结果发现，3种途径进入小鼠体内的微囊藻毒素，70%以上都聚集在肝脏和肾脏，2个脏器单位质量中的微囊藻毒素含量远远高于其他脏器。R Bhattacharya等〔3〕向大鼠腹腔注射微囊藻毒素，1h后即可观察到大鼠肾损害的表现，出现血尿、蛋白尿和胆红素尿，血尿素氮及肌酐明显升高，肾皮质及髓质有炎症改变，有时间?剂量?效应关系，提示微囊藻毒素除了嗜肝之外，还具有嗜肾的特性，肾脏也是微囊藻毒素的靶器官，这一特性是微囊藻毒素肾毒性的基础。
1?2 微囊藻毒素对肝细胞凋亡的诱导 Guzman〔4〕在体内实验观察到，微囊藻毒素中毒动物的肝组织损伤明显，可见中央小叶区被炎症细胞浸润，肝细胞出现脂肪样变性及细胞凋亡，存在时间?剂量?反应关系。施玮〔5〕等在研究不同剂量微囊藻毒素的亚急性肝毒性实验中亦观察到相似的结果，染毒组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酸(AST)升高，肝细胞变性、破坏和幼稚型细胞增生。免疫组化检测显示，随着染毒剂量增加，肝细胞凋亡率显著增加，凋亡增加速度大于增生速度，说明微囊藻毒素能诱导肝细胞凋亡，肝细胞凋亡可能是其致肝脏毒性的原因，在体外原代培养大鼠肝细胞微囊藻毒素染毒后亦观察到肝细胞的凋亡，与体内实验结果一致〔6〕。
1?3 微囊藻毒素对肾细胞凋亡的诱导 Nobre等〔7〕离体灌注鼠肾染毒MC?LR(L、R分别代表亮氨酸和精氨酸)，90min后即发现肾小管钠的转运率大为减少，尿样中出现蛋白质，肾浓缩功能下降，肾小球滤过膜受损。Milutinovic等〔8〕给Wistar雄鼠隔天腹腔注射10μg/kg的MC?LR或MC?YR(Y、R分别代表酪氨酸和精氨酸)，连续8个月，也观察到肾皮质、髓质的损伤，主要是肾小管损伤，小管内充满同质嗜酸性物质，小管细胞凋亡和细胞坏死并存。Fischer〔9〕给鲤鱼喂饲相当于400μg/kg MC?LR的铜绿微囊藻毒素1h后，免疫学方法显示，毒素分布在肾近端小管细胞内，随时间的延长而增加。组织学检查发现，在肾小球近端小管P2段有单个上皮细胞空泡形成，细胞凋亡，脱落，肾皮质及髓质连接处出现蛋白质样脱落物。傅文宇等〔10〕通过流式细胞仪结合碘化丙啶/钙依赖磷脂结合蛋白Ⅴ(PI/Annexin Ⅴ)双染色法检测经微囊藻毒素染毒处理的体外培养的正常大鼠肾细胞发现，当MC?LR的浓度为100nmol/L时，凋亡率为5?77%，当浓度为1000nmol/L时，凋亡率为18?93%，有良好的剂量?反应关系。实验结果表明，微囊藻毒素能诱导肾细胞凋亡产生，细胞凋亡可能也是微囊藻毒素肾毒性的基础。
1?4 微囊藻毒素对淋巴细胞凋亡的诱导 微囊藻毒素还能够通过诱导淋巴细胞的凋亡，从而影响机体的免疫功能。Lankoff〔11〕等在体外实验发现，MC?LR在0?01mmol/L诱导12h就能够引起人的外周血淋巴细胞凋亡，并呈时间?剂量?效应关系。张建英等〔12〕用微囊藻毒素体外诱导鲫鱼的淋巴细胞，亦有相似的结果。但是，与哺乳动物细胞相比，微囊藻毒素诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡更为快速，1nmol/L的MC?LR处理鲫鱼淋巴细胞，2h后即可检测到典型的细胞凋亡。此外，张建英及Lankoff均在实验早期即可检测到淋巴细胞DNA的损伤。因而推测，MC通过损伤DNA引起细胞凋亡〔11，12〕。Teneva等〔13〕在体外实验发现，微囊藻毒素也能引起大鼠的B?淋巴细胞凋亡。以上结果均来自体外实验。
2 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的机制
2?1 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的基础 微囊藻毒素诱导细胞凋亡的具体机制目前仍未完全清楚，大体可能有以下3种途径：阻滞细胞分化、损伤细胞DNA及损伤细胞线粒体导致细胞凋亡。不管哪种途径导致的细胞凋亡，微囊藻毒素对蛋白磷酸酶(PPs)的抑制都起着重要的作用。现已证实〔14，15〕，微囊藻毒素通过与PP1的273位半胱氨酸共价结合而抑制蛋白磷酸酶1(PP1)的活性，通过与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的266位半胱氨酸共价结合抑制PP2A的活性。此外，Chen等〔16〕发现，微囊藻毒素还能够与人肝细胞线粒体的醛脱氢酶2(Human live ALDH2)的447?451位氨基酸残基结合，使ALDH2失去活性，诱导活性氧的产生，导致细胞凋亡。
2?2 微囊藻毒素阻滞细胞分化 施玮等〔17〕用不同浓度微囊藻毒素染毒培养原代肝细胞，然后测定染毒细胞各个细胞周期的细胞数和细胞的凋亡情况。结果发现,染毒肝细胞生长促进率分别是对照组的102?42%，107?88%和111?52%。染毒组肝细胞伸展提前，呈现出时间?剂量?效应关系；同时观察到典型的凋亡改变和G2/M期阻滞，对照组和3个染毒组肝细胞凋亡率分别为6?47%，22?20%,37?73%和49?7%。由此认为,MC?LR通过促进细胞伸展诱导肝细胞去分化，使细胞进入增殖阶段，同时又能在G2/M期阻滞细胞继续增殖，使增殖细胞不能顺利进入下一个周期的G0期，而是向凋亡方向，导致肝细胞的凋亡。
2?3 微囊藻毒素损伤细胞DNA 有学者在对微囊藻毒素的促癌研究中发现〔18〕，微囊藻毒素能够损伤小鼠胚胎成纤维细胞和幼地鼠肾细胞BHK?21的DNA，并认为DNA损伤是微囊藻毒素具有遗传毒性的基础。但是，Lankoff〔11〕在MC诱导淋巴细胞凋亡的研究中发现,DNA损伤后并没有引发染色体畸变及染色体异常(chromosome aberrations CA)，而是继发性的引起细胞凋亡，DNA损伤程度加重，细胞凋亡率亦随之增高，两者之间存在正相关关系。张建英〔12〕等在鲫鱼淋巴细胞凋亡的研究中亦观察到相类似的现象，得出微囊藻毒素快速诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡是通过损伤淋巴细胞DNA而引发的结论。其机制可能是微囊藻毒素诱导细胞内基因组DNA损伤，如果DNA损伤程度过重，不能修复，细胞则会启动凋亡程序产生凋亡。Zegura〔19〕在研究微囊藻毒素对人肝瘤细胞HepG2的影响中观察到，微囊藻毒素能够引起HepG2细胞DNA链的断裂，同时发现有活性氧ROS的出现，由此推断，MC对DNA的损伤可能是一种直接的氧化损伤。为了验证设想，他在实验中加入了活性氧抑制剂(DMSO)，在DMSO存在的情况下，检测不到断裂的DNA链，细胞也没有发生凋亡。实验结果表明，微囊藻毒素很可能通过直接氧化导致细胞DNA损伤，再启动凋亡程序产生凋亡。
2?4 微囊藻毒素损伤细胞线粒体 Ding等〔20〕发现，微囊藻毒素诱导原代培养的大鼠肝细胞凋亡速度很快，50min之内即可观察到典型的凋亡细胞。这与传统的细胞凋亡诱导速度(通常超过6h)差别很大，因而，Ding认为，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡可能存在另外的途径。Ding等〔20-22〕发现，微囊藻毒素通过破坏线粒体的传递链的功能，细胞内活性氧ROS(主要以H2O2及O-2为代表)水平即明显升高，引发细胞线粒体膜电位的丧失(MMP)及通透性改变(MPT)，最后导致细胞凋亡。Mikhailov等〔23〕发现,微囊藻毒素可以与三磷酸腺苷(ATP)合成酶的亚基形成加合物而使酶失活。而ATP合成酶是线粒体的核心结构—电子传递链的一个重要成分，当ATP合成酶失活后，电子传递链的功能也随之丧失，揭示了微囊藻毒素使线粒体的电子传递链失活的机制。在传统的凋亡诱导途径中，Caspase(一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)是细胞凋亡的执行者。特别是Caspase?3，一旦被激活，往往意味着细胞凋亡的发生。但是，Ding在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡实验中〔22〕并没有检测到Caspase?3的活性，却发现钙蛋白酶的活性显著增高。为了明确钙蛋白酶在细胞凋亡中的作用，在实验中加入钙蛋白酶的抑制剂。结果发现，当钙蛋白酶被抑制后，虽有线粒体的损伤，但细胞凋亡并没有出现。Fladmark等〔24〕发现，Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡中也是必需的。但对于微囊藻毒素如何激活Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ和钙蛋白酶，目前尚无确切的实验依据。Ding推测可能是线粒体膜的通透性增加而使Ca2+外流，细胞质中Ca2+浓度随之增高，进而激活了Ca2+依赖蛋白激酶Ⅱ和钙蛋白酶，最后导致细胞凋亡。然而，傅文宇等〔25〕发现，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡，确有Caspase?3的激活，而且呈剂量?效应关系。据此认为微囊藻毒素损伤线粒体后，细胞色素C和凋亡蛋白激活因子释放到细胞浆中并结合形成复合物，再激活Caspase?3引起细胞凋亡。Chen等〔26〕在用不同剂量微囊藻毒素对小鼠肝细胞诱导的凋亡研究中发现，微囊藻毒素诱导的细胞凋亡存在2个独立的途径，ROS结合Ca2+途径及BID?BAX?BCL?2途径(BID，BAX，BCL?2均是凋亡基因BCL?2家族中的基因蛋白，其中，BID和BAX是促进凋亡蛋白，而BCL?2是抗凋亡蛋白)，2个途径均以线粒体受损为关键步骤。小鼠肝细胞在大剂量微囊藻毒素时［>70μg/(kg·bw)］，表现为ROS及Ca2+凋亡途径，类似于Ding的描述，主要差别表现在细胞内活性氧由铁蛋白诱导产生，而不是来源于线粒体。小剂量微囊藻毒素时［<50μg/(kg·bw)］，则通过BID?BAX?BCL?2途径，主要通过Bcl?2基因家族表达的蛋白调控细胞凋亡，大体过程为微囊藻毒素在上调Bid表达的同时下调Bcl?2表达，Bid激发Bax表达增加，这些表达产物综合作用使线粒体膜通透性增加，细胞色素C从中释放到细胞质，最后导致细胞凋亡。可见，通过线粒体损伤引起细胞凋亡的具体机制，特别是从线粒体损伤之后到最终细胞凋亡这一阶段的生化过程，不同学者的实验结果相差较大，目前难以形成一致结论，尚需进一步研究明确。但是，线粒体损伤是细胞凋亡的关键已得到大多数学者认可。
3 结语
关于微囊藻毒素诱导细胞凋亡的研究很多，现已明确，诱导细胞凋亡是微囊藻毒素发挥其毒性的关键，对于细胞凋亡的诱导具有广泛性，除了能够诱导肝细胞凋亡外，还能诱导肾脏有关细胞及淋巴细胞的凋亡；至于微囊藻毒素如何诱导细胞凋亡，总的来说有3种途径：阻滞细胞分化、损伤细胞DNA及损伤细胞线粒体，目前以线粒体损伤途径的研究最为充分和广泛，但在具体机制方面仍未取得统一结论，存在许多分歧。此外，在PPS抑制及线粒体损伤的关联，微囊藻毒素对细胞增殖及凋亡的影响，以及微囊藻毒素在体内代谢的具体过程等关键问题上，目前亦未定论。今后的研究应进一步明确微囊藻毒素具体的致病机制，为微囊藻毒素的急、慢性中毒提供理论依据。
【】
〔1〕 Fisher W J，Altheimer S，Cattori V，et al.Organic anion transporting polypeptides expressed in liver and brain mediate uptake of microcystin［J］.Toxicol Appl Pharmacol,2005,203(3)：257?263.
〔2〕 张占英，俞顺章，卫国荣，等.微囊藻毒素LR在动物体内整体水平及细胞水平的分布［J］.卫生毒杂志，2002，16(1)：5?8.
〔3〕 Bhaooacharya R，Sugendran K Dangi RS，et al.Toxicity evaluation of fresh water cyanobacterium microcystins aerugmosa PCC 7806：Ⅱ Nephrotoxicity in Rats［J］.Biomed EnvironSci,1997,10(1)：93?101.
〔4〕 Guzman RE，Solter P. Hepatic oxidative stress following prolonged sublethal microcystin LR exposure［J］.Toxicol Pathol，1999，27(5)：582?588.
〔5〕 施玮，朱惠刚，晏晓蓉，等.低剂量微囊藻毒素亚急性肝毒性及其机理［J］.环境科学，2002,23(5):47?51.
〔6〕 施玮，朱惠刚，晏晓蓉，等.微囊藻毒素MC?LR对肝细胞毒性机理研究［J］.公共卫生，2002，18(2)：139?140.
〔7〕 Nobre AC，Jorge MC，Menezes DB，et al.Effects of microcystin?LR in isolated perfused rat kidney［J］.Braz J Med Biol Res,1999，32(8)：985?988.
〔8〕 Milutinovic A，Sedmak B，Horvat?Znidarsic I，et al.Renal injuries induced by chronic intoxtcation with microcystins［J］.Cell Mol Biol Lett,2002，7(1)：139?141.
〔9〕 Fischer WJ，Dietrich DR.Pathological and biochemical characterization of microcystin?induced hepatopancreas and kidney damage in carp(Cyprinus carpio)［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2000,164(4)：73?81.
〔10〕 傅文宇，李敏伟，徐立红，等.用流式细胞仪P1/Annexin V双染色法检测微囊藻毒素LR诱导的大鼠肾细胞凋亡［J］.水生生物学报，2004，28(1)：82?83.
〔11〕 Lankoff A，Krzowski L,Glab J，et al.DNA damage and repair in human peripheral blood lymphocytes following treatment with microcystin?LR［J］.Mutat Res，2004,559(1?2)：131?142.
〔12〕 张建英，张杭君，陈英旭.微囊藻毒素导致鲫鱼淋巴细胞凋亡的研究［J］.环境科学学报，2005，25(8)：1101?1104.
〔13〕 Teneva I，Mladenov R，Popov N，et al.Cytotoxicity and apoptotic effects of microcystin?LR and anatoxin?a in mouse lymphocytes［J］.Folia Biol(Praha),2005,51(3)：62?67.
〔14〕 Runnegar M，Berndt N，Kaplowitz N.Microcystin uptake and inhibition of protein phosphatases：effects of chemoprotectants and self?inhibition in relation to known hepatic transporters［J］.Toxicol Aopl Pharmacol，1995,134(2)：264?272.
〔15〕 MacKintosh RW，Dalby KN，Campbell DG，et al.The cyanobacterial toxin microcystin binds covalently to cysteine?273 on protein phosphatase 1［J］.FEBS Lett，1995,371(3)：236?240.
〔16〕 Ting Chen，Jun Cui，Yan Liang,et al.Identification of human live mitochondrial aldehyde dehydrogenase as a potential target for microcystin?LR［J］.Toxicology，2006，220：71?80.
〔17〕 施玮，朱惠刚，晏晓蓉，等.微囊藻毒素MC?LR对原代肝细胞的影响［J］.环境与职业医学，2002，19(3)：129?131.
〔18〕 Rao PVL,Bhattacharya R，Parida MM，et al.Freshwater cyanobacterium Microcystins aeruginosa(UTEX 2385)induced DNA damage in vivo and in vitro［J］.Environ Toxicol Pharmacol，1998,5：1?6.
〔19〕 Bojana Zegura，Bojan Sedmak，Metka Filipic.Microcystin?LR induces oxidative DNA damage in human hepatoma cell line HepG2［J］.Toxicon,2003，41(1)：41?48.
〔20〕 Ding WX，Shen HM，Ong CN.The critical role of ROS and mitochondrial membrane permeability in microcystin?LR induced rapid apoptosis in primary rat hepatocytes［J］.Hepatology，2000，32(3)：547?555.
〔21〕 Ding WX，Shen HM，Zhu HG,et al.Studies on oxidative damage induced by cyanobacteria?extract in primary cultured rat hepatocytes［J］.Environ Res，1998，78(1)：12?18.
〔22〕 Ding WX，shen HM，Ong CN.Calpain activation after mitochondrial permeability transition in microcystin?induced cell death in rat hepatocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，291(2)：321?331.
〔23〕 Mikhailov A，Harmala?Brasken AS，Hellman J，et al.Identification of ATP?synthase as a novel intracellular target for microcystin?LR［J］.Chem Biol Interaet，2003，142(3)：223?237.
〔24〕 Fladmark KE，Brustugun OT，Mellgren G，et al.Ca2+/calmodulin?dependent protein kinase Ⅱis required for microcystin?induced apoptosis［J］.J Biol Chem，2002，277(4)：2804?2811.
〔25〕 傅文宇，陈加平，徐立红.Caspase?3在微囊藻毒素诱导的细胞凋亡中的作用［J］.中国环境科学，2004，24(1)：6?8.
〔26〕 Ting Chen，Qingsong Wang，Jun Cul，et al.Induction of apoptosis in mouse livet by microcystin?LR［J］.Mol Cell Proteomics，2005，4(7)：958?974.
