组织芯片检测snail mRNA的表达及其与胃癌的关系
作者：张莉丽 张布衣 姚根有
【摘要】 目的 探讨转录因子snail mRNA在胃癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法 制作组织芯片，在组织芯片上通过原位杂交检测snail mRNA在25例非肿瘤胃黏膜组织和100例胃癌组织中的表达情况。结果 100例胃癌中snail mRNA的阳性表达率46%，snail mRNA的阳性表达率与胃癌的TNM分期（r=0.176, P=0.027）、淋巴结转移（r=0.299, P=0.003）、脉管转移（r=0.208, P=0.038）、分化程度（r=0.203, P=0.042）呈正相关，与胃癌的病灶大小、浸润深度、远处转移无明显相关性。snail mRNA 的阳性表达病例的平均生存时间和5年生存率明显低于阴性表达的病例。结论 snail mRNA的表达可预测胃癌的浸润和转移，是指导临床及估计预后的有意义指标。
【关键词】 胃癌 原位杂交 组织芯片
【Abstract】 Objective To explore the expression of snail mRNA in the tissue of gastric cancer and its relationship with the clinical pathologic feature and prognosis . Methods The tissue array was designed , the expressions of snail mRNA in 25 none tumor mucous tisse and 100 gastric cancer tissue were dectected by in situ hybridization on the tissue array and . Resutls The expression rate of snail mRNA in 100 cases of gastric cancer were 46%, which was positively related to TNM staging（r=0.176, P=0.027）、lymphnode metastasis（r=0.299,P=0.003）、vessle metastatis（r= 0.208, P=0.038）and differentiation（r= 0.203, P=0.042）,but not related to the size of cacer , depth of invasiveness and distant metastasis . The average survival time and 5 years survival rate were significantly lower in the cases with the expression of snail mRNA than in the cases without its expression . Conclusions The expression of snail mRNA has a close relationship with the invasiveness and metastasis therefore is helpful in predicting the prognosis and treating of gastric cancer .
【Key words】 Gastic cancer In situ hybridization Tissue array
锌指转录因子snail属于snail超家族成员，首次被描述是在果蝇中，出现在脊椎动物和无脊椎动物的胚胎发育和肿瘤进展中，调节主要的生物功能，如细胞分化、细胞游离、细胞循环和细胞凋亡。作者通过观察snail mRNA在非肿瘤性胃黏膜和胃癌组织中的表达情况，探讨其与胃癌发生、进展、浸润、转移及预后的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
收集本院1995年1月至2000年12月胃癌根治标本100例，所有病例术前均未经任何治疗。男70例，女30例(男女比例2.3：1)；年龄29～82岁(中位年龄为62岁)。参照WHO胃癌分类标准［１］，乳头状腺癌6例，管状腺癌31例，黏液腺癌6例，印戒细胞癌8例，未分化癌49例；高分化和中分化癌32例，低分化和未分化癌68例。根据2002年美国抗癌协会指定的标准进行TNM分期［２］：T1期21例，T2期28例；T3期33例，T4期18例；周围神经侵犯15例；脉管侵犯54例淋巴结转移49例；远处转移18 例。75例有5年以上完整随访资料，生存期的从手术日期至随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。另取同期25例正常胃黏膜组织作对照。
1.2 方法
制备组织芯片：根据HE切片在每一病例组织蜡块上选取3个代表性区域，制作带有阵列孔的受体蜡块，挖取供体蜡块上选定的区域放入受体蜡块阵列孔中，2次包埋，制成组织芯片蜡块,用德国Leica切片机连续作5μm厚切片，制备过程中所用器具均经灭活RNA酶处理。原位杂交：狄高辛标记的snail (MK652)寡合苷酸探针及相应的原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司，杂交方法按试剂盒说明书进行。snial mRNA检测：石蜡组织芯片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，用0.2N稀盐酸灭活过氧化物酶，蛋白酶K暴露mRNA片段，洗涤，然后42℃ 预杂交2h后滴加杂交液，42℃过夜，充分洗涤后滴加封闭液室温30min，滴加抗体复合物室温 2h，再次充分洗涤后BCIP/NBT室温避光显色12～24h。
1.3 结果判断
snail mRNA阳性染色定位于细胞质中，呈紫蓝色为着色细胞，根据阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比及着色程度判别结果：无明显阳性反应细胞或着色细胞数＜10%为阴性（－），阳性细胞数≥10%或着色较强者为阳性（＋）。
1.4 统计学处理
用SPSS 13.0统计软件。snail mRNA表达与胃癌各临床病理参数间的关系用非参数统计中Spearman等级相关进行分析，对生存数据进行Kaplan－Meier分析，并绘制生存曲线，应用Log－rank检验差异性。
2 结果
2.1 snail mRNA的表达及其与胃癌关系
见表1。25例非肿瘤性胃实质细胞中4例snail mRNA阳性表达(占16%)，100例胃癌组织中46例snail mRNA染色阳性(占46%)，两者差异有统计学意义（P=0.000）。阳性表达主要见于胃癌细胞浆中，部分位于胞核中，间质中的巨噬细胞和成纤维细胞中也见散在着色，表达阳性的肿瘤细胞多位于浸润前沿，累及肌层、浆膜、腹膜、胰腺等（图1）。snail mRNA阳性表达率与TNM分期（r=0.176，P=0.027）、淋巴结转移（r=0.299，P=0.003）、脉管侵犯（r=0.208，P=0.038）、分化程度(r=0.203，P=0.042)呈正相关，与病人性别、年龄以及肿瘤的大小、生长方式、浸润深度、组织学类型、神经侵犯、远处转移无明显关系。表1 snail mRNA的表达及其与胃癌进展病理指标关系（略）
2.2 snail mRNA表达与胃癌预后关系
有完整随访资料的75例胃癌病人，snail mRNA阳性表达33例，阴性42例，阴性表达胃癌病人的平均生存时间是阳性表达病人的1.39倍（75个月/54个月），5年生存率（64.30%）也显著高于阳性表达病例（39.4%），阳性表达率与病人的结局呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05），提示预后不良（图2）。
3 讨论
近年的研究表明，snail是一种锌指蛋白转录因子,在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤及口腔鳞癌等肿瘤中表达增高［３，４］。本研究发现，正常胃黏膜组织中snail mRNA表达水平较低，随着胃癌的发生、侵袭及浸润性的增强而表达增强，特别是在TNM Ⅲ-Ⅳ期、分化程度减低及伴有淋巴结转移和血脉管侵犯的胃癌中snail mRNA过表达，提示snail在胃癌中发挥癌基因的作用，其mRNA过表达可促进胃癌的发生、浸润和转移。研究表明，Snail参与胃癌进展主要通过直接抑制E黏附蛋白的表达发挥作用，Snail通过其锌指区域与E-cad启动子中Epal元件（-178 to +92bp）的E盒结构主链上的CANNTG序列结合而发挥其下调E-cad的作用。Miyoshi等［４］最新的研究证明，在肝癌细胞株中，snail不仅抑制E钙黏蛋白的表达，还通过间接调控基质金属蛋白酶家族成员的表达增加细胞的侵袭能力，促进肝癌的进展，生存分析显示，snail mRNA阳性表达的胃癌病人预后差。因此，作者认为，snail mRNA可作为判断胃癌的预后指标，对snail mRNA阳性表达的胃癌病人应尽早施行手术，同时加强术后辅助。
综上所述，snail能够促进胃癌的生长、侵袭、转移，可作为对胃癌进行基因治疗的靶点加以进一步研究，此外，snail还可作为帮助胃癌诊断和判断预后的重要生物学指标。
【】
1 Hamilton SR, Aaltonen LA. World health organization classification of Tumours. pathology and genetics of tumours of the digestive system lyon: IARC Press, 2000. 37～67.
2 Greene FL, ed. AJCC Cancer Staging Manual. 6th ed. Berlin: Springer-Verlag, 2002. 50～61.
3 Elloul S. Snail Slug and Smad interacting protein 1 as novel parameters of disease aggressiveness in metastatic ovarian and breast carcinoma Cancer, 2005, Apr 15; 103(8):1631～1643.
4 Miyoshi A. Snail accelerates cancer invasion by up regulating MMP expression and is associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma. Br J Cancer, 2005,92(2):252～258.
