急性肺损伤中性粒细胞胶原酶表达异常及甲基强的松龙调控的研究
作者：陆卫华 曾尟枚 许喜咏 程青 唐忠志
【摘要】 目的： 探讨急性肺损伤时肺组织中性粒细胞胶原酶的表达及甲基强的松龙调控关系。方法： SD大鼠45只，分为3组：1组生理盐水正常对照组，2组内毒素(LPS)致病组，3组内毒素(LPS)+甲基强的松龙组。组2、组3分别由尾静脉注射内毒素(5 mg/kg)造成大鼠急性肺损伤模型，组1则注入生理盐水。内毒素(LPS)+甲基强的松龙组在实验造模前2 d由腹腔注射甲基强地松龙10mg/kg，1次/d，组1、组2、组3分别于注射后6 h建模后各组均取左肺标本，用免疫组织化学法检测肺组织中中性粒细胞胶原酶的表达，并行肺病理损伤评分、肺内中性粒细胞计数，肺干/湿质量比。结果:内毒素(LPS)致病组和内毒素(LPS)+甲基强的松龙组高于正常对照组中性粒细胞胶原酶相对含量、肺病理损伤评分、肺干/湿质量比、肺内中性粒细胞计数 (P<0．05)。内毒素(LPS)致病组高于内毒素(LPS)+甲基强的松龙组中性粒细胞胶原酶相对含量、肺病理损伤评分、肺干/湿质量比、肺内中性粒细胞计数 (P<0．05)。结论:急性肺损伤性粒细胞胶原酶表达异常与肺损伤有密切关系，甲基强的松龙能调控急性肺损伤时中性粒细胞胶原酶的表达异常。
【关键词】 急性肺损伤； 中性粒细胞胶原酶； 甲基强的松龙
急性肺损伤(ALI)是全身反应综合征(SIRS) 的重要组成部分，在内毒素(LPS)导致的急性肺损伤(ALI)中，中性粒细胞在肺内聚集并且释放炎症因子是一个重要的致病环节［1］。为了解中性粒细胞胶原酶在ALI发病中所起的作用，作者采用尾静脉注射LPS法构建了ALI大鼠模型，并观察中性粒细胞胶原酶在ALI中的作用，并用甲基强的松龙进行调控干预，收到显著效果。
1 材料和方法
1.1 动物分组
SD大鼠45只，购至华中科技大学同济医学院动物实验中心，体质量(200±40)g，随机分为3组：生理盐水对照组15只；内毒素(LPS)模型组15只；内毒素(LPS)+甲基强的松龙组15只。甲基强的松龙购自美国辉瑞-法玛西亚公司生产。
1.2 动物模型制备
固定大鼠，先静脉注射3mg/L苯巴比妥钠(30mg·kg-1)麻醉, 5min后经尾静脉注射(5 mg·kg-1)LPS复制大鼠ALI模型。生理盐水对照组注射同量生理盐水。内毒素(LPS)+甲基强的松龙组在实验造模前2 d由腹腔注射甲基强的松龙10mg/kg，1次/d。造模后6h分别经静脉注射过量的苯巴比妥钠处死，取左下叶肺组织一块，-70℃ 冻存待检。对照组大鼠不注射LPS，处死后取左下叶肺组织。
1.3 测肺组织中性粒细胞胶原酶检测
采用免疫组织化学SABC法，一抗是多克隆山羊抗大鼠中性粒细胞胶原酶抗体(中山生物公司)。肺组织石蜡包埋后切片，固定于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经梯度乙醇脱水、脱蜡后，又经甲醇处理5min后，封闭内源性过氧化物酶。磷酸缓冲液(pH6．0)120℃加热5 min。滴加一抗孵育30 min，然后滴加二抗，再孵育30 min后，加入显色剂DAB。细胞浆中显棕黄色颗粒为阳性细胞，以半定量的方法判断结果 ，阳性细胞定量参数用MPIAS-1000型光密度自动分析仪(Nikon，Japan)进行检测。
1.4 肺组织病理损伤评分
标本经HE染色，显微镜下观察。根据Tomashefski等介绍的10个观察指标(肺泡上皮细胞破坏、毛细血管阻塞、肺间质水肿、肺泡内水肿、出血、单核细胞浸润、多型核细胞浸润、肺泡间质水肿、透明膜形成、间质胶原降解)判断肺损伤：分4个级别，0为未观察到损伤、1为轻度、2为中度、3为重度。每张切片各观察指标病理评分的总和为该切片总评分，每组观察5张切片，取均值。
1.5 肺组织干/湿质量比
取左下叶肺组织称量， 70℃烘烤24 h后再称量，肺干/湿质量比。
1.6 肺组织内中性粒细胞计数
标本经HE染色后在400倍显微镜下观察，随机选取10个视野，用血细胞计数器计数中性粒细胞数。
1.7 统计学分析
所有数据用均数方差分析，采用SPSS11.0统计软件对各组均数进行处理，两组间比较用t检验，以P<0．05为差异有显著性。
2 结果
各组大鼠中性粒细胞胶原酶含量、中性粒细胞计数、肺干/湿质量比、病理评分结果见表1。HE染色结果显示: C组中未见到肺组织炎症反应见（图1）, L组可观察到严重的肺炎症反应见（图2）,即中性粒细胞浸润、透明膜形成、肺泡间组织肿胀突入肺泡腔中,M组肺炎症较L组减轻见（图3）。中性粒细胞胶原酶染色结果显示: C组中几乎未见中性粒细胞胶原酶染色阳性的中性粒细胞, L组可见强阳性染色中性粒细胞,并且主要定位于细胞浆中，M组中中性粒细胞胶原酶染色阳性的中性粒细胞较L组减少。表1 各组大鼠中性粒细胞胶原酶相对含量、肺病理损伤评分、肺干／湿质量比、肺内中性粒细胞计数
3 讨论
急性肺损伤是急性创伤和感染常见病。在临床ICU所有病例中，由细菌内毒素所引发的ALI和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)占有重要比例，其发病率和病死率均较高［2,3］。在对ALI的研究中，均可以观察到有大量中性粒细胞在肺组织中聚集，而中性粒细胞可以释放多种炎症介质导致ALl的发生［4,5］，因而目前对于这些炎症介质的研究是一个热点。
人体组织器官是由各种细胞成分及细胞外基质 (ECM)构成，ECM 是维系器官结构稳定的基础．在器官构成中起"框架"作用。中性粒细胞胶原酶是基质金属蛋白酶中的一种，仅来源于成熟分化的中性粒细胞。中性粒细胞胶原酶能降解ECM 中的Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ 型胶原成分，而这3种胶原成分是ECM 中的重要组成成分，对组织结构起连接、支持、稳定作用 ，所以，在炎症反应性疾病中，中性粒细胞胶原酶分泌增多，必然大量分解ECM 中的胶原成分，造成组织器官结构与功能破坏，持续释放大量的毒性内容物加剧肺损伤的病理过程，本实验结果完全符合此结论［6,7］。
本实验结果还显示在急性肺损伤组中性粒细胞胶原酶含量显著高于生理盐水正常对照组和内毒素(LPS)甲基强的松龙组。说明急性肺损伤组中性粒细胞胶原酶含量明显异常。内毒素(LPS)急性肺损伤组和内毒素(LPS)甲基强的松龙组中性粒细胞胶原酶含量差异有显著性。内毒素(LPS)甲基强的松龙组中性粒细胞胶原酶含量较内毒素急性肺损伤组比例显著减少。说明甲基强地松龙能够调控油酸内毒素(LPS)造成急性肺损伤后中性粒细胞胶原酶含量，对急性肺损伤有明显有保护作用。但是甲基强的松龙对急性肺损伤有明显有保护作用尚不能完全抵消内毒素肺损伤肺组织中PMN释放中性粒细胞胶原酶的影响。其作用机制有待进一步研究。
【】
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