MMP9、CD44v6在皮肤鳞状细胞癌和基底细胞癌中表达的对比研究

                   作者：王琦 刁路明 孙凯 付文荣 田英

【摘要】  目的：探讨基质金属蛋白酶MMP9、细胞粘附因子CD44v6在皮肤鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma,SCC）和基底细胞癌（Basal cell carcinoma,BCC）中表达的意义及相关性。方法：采用免疫组织化学法对82例石蜡包埋组织标本进行检测和统计分析。结果：①MMP9在皮肤SCC中阳性率（88.1%）显著高于皮肤BCC组（48%）和正常皮肤组（13.3%），CD44v6在正常皮肤中的阳性率（100%）显著高于皮肤SCC组（66.7%）和皮肤BCC组（20%）；②MMP9的高表达率与皮肤SCＣ的分化程度呈负相关，CD44v6的高表达率与皮肤SCC的分化程度呈正相关；③MMP9和CD44v6在皮肤SCC和BCC中表达无明显相关。结论：CD44v6和MMP9与皮肤BCC和SCC的发生、分化密切相关，可作为研究和判断皮肤SCC和BCC生物学行为和预后独立的重要指标。

【关键词】  鳞状细胞癌； 基底细胞癌； MMP9； CD44v6； 免疫组织化学

 MMP9是蛋白水解酶中较为重要的一类，参与细胞外基质和细胞膜的降解，促进肿瘤侵袭和转移［1］。CD44是一类分布广泛的跨膜糖蛋白，参与机体各种生理功能，其外显子按表达和拼接方式的不同分为CD44s和CD44v［2］，其中CD44v6与肿瘤侵袭和转移关系最为密切。皮肤SCC和BCC均是皮肤角朊细胞来源的肿瘤，其中SCC是皮肤恶性肿瘤中最常见的一种，占40%以上。CD44v6或MMP9在皮肤肿瘤中报道极少，而CD44v6和MMP9在皮肤BCC和SCC中对比研究，国内外尚未见报道。本研究运用免疫组化法检测MMP9和CD44v6的表达情况，研究其与皮肤肿瘤的病理类型、分化程度的关系及两种蛋白表达的相关性，现报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  标本采取和临床资料  82例病理研究标本取自同济医学大学附属襄樊市中心病理科2000～2007年病理存档的石蜡标本，均经组织病明确诊断。男45例，女37例，年龄32～65岁，平均46岁。其中皮肤鳞状细胞癌患者42例（高分化鳞癌15例，中分化鳞癌13例，低分化鳞癌14例），皮肤基底细胞癌25例，正常皮肤15例（取自我科整形手术中切取的正常皮肤）。

    1.1.2  主要试剂  即用型鼠抗人MMP-9单克隆抗体、即用型鼠抗人CD44v6免疫组化单克隆抗体、SP免疫组化染色试剂盒均购于福州迈新生物技术开发公司；二氨基联苯胺（DAB）显色剂购于北京中山生物技术公司。

    1.1.3  主要仪器   -80℃超低温冰箱；CX51日本Olympus光学照相显微镜；德国Leica组织切片机；YWY781B医用微波炉。

    1.2  方法

    1.2.1  固定和石蜡包埋  所有标本经10%中性甲醛常规固定，石蜡包埋。制成4μm厚连续切片，分别做HE染色和免疫组化染色。

    1.2.2  免疫组化染色方法  (1)石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3分钟；(2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液置于微波盒中，用大火煮开，再将组织片浸没在修复液中，加盖，中火煮15分钟，取出微波盒，冷却至室温后，取出组织片；(3)每张切片加50μl过氧化酶阻断溶液 (试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min；(4)PBS(pH7.4)冲洗3×3′。(5)沥干PBS液，每张切片加50μl的非免疫性动物血清(试剂B)，室温孵育10min；(6)甩去血清，分别加MMP9(浓度1:100)和CD44v6 (浓度1:300)工作液50μl，4℃冰箱中过夜；(7)第二天将过夜切片用PBS冲洗3×5′；(8)沥干PBS液，每张切片加50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温孵育20min；(9)PBS冲洗3次，每次3min；(10) 沥干 PBS液，每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育20min。PBS冲洗3次，每次3min；(11)沥干PBS液，每张切片加100μl的新鲜配置的酶底物显色液（DAB）进行显色5min；(12)自来水冲洗，苏木素复染，用中性树胶进行封片； (13)用PBS代替一抗作空白对照。

    1.3  免疫组化结果判定

    CD44v6蛋白阳性表达为细胞膜上有棕黄色颗粒样物质沉着。MMP9蛋白阳性表达为细胞浆内有棕黄色颗粒样物质沉着。结果判定采用半定量积分法，免疫组化染色记分标准如表1，以染色强度与阳性细胞的百分比的乘积做为半定量标准。MMP9以0～3分为阴性（-），4～6分为弱阳性（+），7～9分为阳性（++），10～12分为强阳性（+++）［3］；CD44v6以0分为阴性（-），1分为弱阳性（+），2～3分为阳性（++），大于3分为强阳性（+++）［4］。阳性和强阳性统称为高表达。表1  免疫组化染色记分标准

    1.4  统计学处理 

    应用SPSS10.0软件分析系统，采用χ2检验和精确概率法及计数资料的相关性分析，以P<0.05时认为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  MMP9、CD44v6在正常皮肤、皮肤SCC和皮肤BCC中的表达

    MMP9阳性定位于癌细胞胞浆中，从正常皮肤到BCC，直到SCC，MPP9表达逐渐增强，各组间阳性表达率比较有统计学意义（P<0.05）。CD44v6的阳性表达定位于癌细胞胞膜上，从正常皮肤到SCC，直到ＢCC，CD44v6表达逐渐下降，各组间阳性表达率比较有统计学意义（P<0.05），见表2,3。表2  MMP9在正常皮肤、皮肤SCC及BCC中的表达注：与SCC组比较，χ2=12.824, △P<0.01；与正常皮肤组比较，χ2=28.590, # P<0.01; 与正常皮肤组比较，χ2=4.952, * P<0.05。表3  CD44v6在正常皮肤、皮肤SCC及BCC中的表达注：与SCC组比较，χ2=4.956, △P<0.05；与BCC组比较，χ2=24.000, # P<0.01; 与BCC组比较，χ2=13.666, * P<0.01。

    2.2  MMP9和CD44v6与皮肤SCC的分化程度关系

    MMP9在皮肤SCC高、中、低分化组中高表达率分别为33.3%、61.5%、92.8%,MMP9的高表达与皮肤SCC分化程度呈负相关（χ2=10.881,P<0.01）。

    CD44v6在皮肤SCC高、中、低分化组中高表达率分别为60.0%、23.1%、7.1%,CD44v6的高表达与皮肤SCC分化程度呈正相关（χ2=13.940,P<0.01），见表4。表4  MMP9、CD44v6表达与皮肤SCC分化程度关系

    2.3  皮肤SCC和BCC中CD44v6和MMP9表达的相关性

    计数资料相关性分析显示，CD44v6与MMP9的表达在皮肤SCC和BCC中均无明显相关，见表5，6。表5  皮肤BCC中CD44v6与MMP9表达的关系注：CD44v6与MMP9表达无明显相关（P>0.05）。 表6  皮肤SCC中CD44v6与MMP9表达的关系注：CD44v6与MMP9表达无明显相关（P>0.05）。

    3  讨论

    基质金属蛋白酶（MMPs）是一组高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，是蛋白水解酶中较为重要的一类，可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质。MMP9是MMPs中相对分子量最大的酶，其分子量是92KD，人类MMP9基因位于染色体20q12-q13。Dumas等曾对皮肤肿瘤中MMP9进行研究，发现鳞状细胞癌中MMP9表达高于基底细胞癌［5］，这与本研究相符。我们观察到MMP9表达与皮肤肿瘤的病理类型及分化程度密切相关，随着恶性程度增高、分化降低、侵袭力增强，MMP9表达增高。说明皮肤肿瘤的转移、浸润机理之一是通过增加MMP9分泌，促进癌细胞浸润到细胞外基质（ECM）和血管间质中,提示MMP9高表达与皮肤SCC及BCC发生、密切相关。

    CD44v6是淋巴细胞的导向受体，在淋巴细胞的活化、细胞与细胞间粘附、细胞与基质间相互作用及细胞的运动中发挥多种功能。近年来，广泛的CD44v6研究表明，在消化道癌、肺癌、宫颈癌中CD44v6表达增强，且鳞癌表达高于腺癌，而在皮肤肿瘤［5，6］、口腔肿瘤［7］中表达下调（与本研究相符），表明CD44v6表达与肿瘤类型及组织来源有关。本研究显示CD44v6在皮肤鳞癌和基癌中表达明显低于正常皮肤中表达，在皮肤鳞癌中CD44v6高表达与细胞分化程度正相关，提示CD44v6可能在维持角质形成细胞正常形态及增殖分化过程中起作用，并通过与其他淋巴细胞功能相关抗原相互作用发挥局部抗肿瘤免疫作用，癌变过程中细胞获得了表达CD44v6蛋白的阻断信号导致低表达。这也可能与异常增生时细胞粘附力下降有关。CD44v6可以作为一个研究皮肤SCC和BCC发生、发展的分子生物学标志，并且在一定程度上可以作为皮肤SCC分化程度及病理分级的指标。皮肤BCC的癌细胞基本不表达CD44v6，这与Simon［8］1996年对基癌CD44v6表达下调的研究结果相吻合。虽然正常基底细胞高表达CD44v6，但在发展成癌细胞后，CD44v6结构改变或功能失活，从而不能与相应抗CD44v6抗体结合而表现为CD44v6免疫组化阴性。

    本研究表明，虽然CD44v6和MMP9均与皮肤SCC、BCC的发生、发展及组织分化密切相关，但它们之间没有相关性，因此在皮肤SCC和BCC的诊断、、预后及生物学行为研究上，可作为独立的判断指标。

【参考】
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2 Guttman D, Stem Y, Shpitzer T, et al. Expression of MMP-9,TIMP-1,CD-34 and factor-8 as prognostic mark-ers for squamous cell carcinoma of the tongue. Oral Oncol,2004,40(8):798～803.

3 Guler G, Sarac S,Uner A,et al .Prognostic value of CD44variant 6 in laryngeal epidermoid carcinomas. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2002,128(4):393～397.

4 Dumas V, Kanitakis J,Charvat S, et al. Expression of basement membrane antigens and matrix metalloproteinases 2 and 9 in cutaneous basal and squamous cell carcinomas Anticancer Res,1999,19(4B):2929～2938.

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8 Simon S, Wolfgang T, Karin H. Expression of CD44 splice variants in human skin and epidermal tumours. Virchows,1996,428:141～149.