当归注射液预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌ICAM-1表达的变化
【摘要】 目的：观察当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞内ICAM-1表达的变化，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将35只SD大鼠随机分成4组(n = 10):正常对照组(n = 5)；假手术组(n = 10)；缺血再灌注组(n = 10)；当归组(n= 10) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做免疫组织化学染色；观察各组动物心肌细胞内p53蛋白表达的变化。利用HPIAS-2000图像分析系统测定ICAM-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：正常对照组心肌细胞内ICAM-1表达低呈阴性；当归治疗组心肌细胞内ICAM-1表达较低呈阴性。假手术组心肌细胞内ICAM-1表达也较低呈弱阳性，缺血再灌注损伤组ICAM-1表达较高呈阳性。图像分析结果显示：正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间ICAM-1表达的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间ICAM-1表达的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。
【关键词】 当归注射液 缺血再灌注 心肌 ICAM-1表达
缺血是供血障碍引起的组织供血不足的病理表现, 组织缺血导致的疾病称缺血性疾病, 是可以发生在多种组织器官上的常见疾病。再灌注是指组织缺血后恢复供血的过程, 缺血再灌注实际上包括缺血和再灌注两个方面, 缺血是引起疾病的原因, 也是再灌注的条件。缺血性疾病的治疗需要改善供血, 改善供血的过程又是再灌注的过程, 往往可以加重组织的损伤［1］。
当归的药用价值早已为人们所认识, 其药理作用主要是：①促进机体免疫；②对呼吸系统的作用；③对血液循环系统的作用，有报道［2］。冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用。因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性ST-T 的变化, 是治疗冠心病的有效药物［3］。当归具有钙通道阻滞作用, 拮抗钙超载, 对心肌缺血再灌注所致心肌损伤有保护作用。在缺血及再灌注状态下, 心脏顺应性及射血功能得到良好的保护, 使反映心肌损伤程度的CPK 活性和氧自由基损伤过程产生的过氧化脂质分解产物MDA的浓度大大降低［4］。中药对心肌缺血的治疗有其独特性和有效性，尤其是中药具有毒副作用小、效果确切的特点。近年来，有不少学者对中药预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行了研究与探索。
本实验采用免疫组织化学方法观察当归注射液对缺血/再灌注过程心肌的保护作用,研究当归注射液抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机理。旨在指导临床合理应用当归治疗心血管疾病,开辟当归在体外循环手术前和术中应用的新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物模型制备及分组
选用健康雄性Wistar大鼠（SPF级）35只,体重250～300g左右。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg·(100 g) -1 ,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［ 呼吸频率60 次·min -1 ,潮气量2ml·(100g) -1］,沿胸骨左缘第4肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成四组: 正常对照组（不做任何处理）；假手术组（丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎）；缺血再灌注损伤组(IR)（ 缺血/ 再灌注前静脉注射生理盐水0.8ml / kg，结扎左冠状动脉前降支45min ,再灌注120 min ）；当归注射液预处理组（在结扎前20min，静脉注射当归注射液0.8ml/ kg , 其它处理同缺血/ 再灌注组）。
1.2 主要试剂
25%当归注射液(武汉大学中南制药厂)；即用型兔抗鼠ICAM-1单克隆抗体，即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于北京中山生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 常规HE染色
取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。
1.3.2 免疫组织化学S-P法检测ICAM-1相关抗原
主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，ICAM-1均采用高压抗原修复，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人乳腺癌作为ICAM-1的阳性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
ICAM-1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对ICAM-1抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 HE染色
正常对照组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核位于细胞中央，细胞界限清晰，结构正常；假手术组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解，结构基本上正常；缺血再灌注损伤组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂；当归治疗组：可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，细胞结构基本正常。
2.2 ICAM-1的表达
正常对照组：心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，ICAM-1表达极弱或无表达；假手术组：心肌细胞内可见极少量的棕黄色颗粒，ICAM-1表达极弱；缺血再灌注损伤组：心肌细胞内有较多棕黄色颗粒，ICAM-1表达强；当归组：心肌细胞内无棕黄色颗粒沉积，ICAM-1表达极弱或无表达。图像分析结果显示：正常对照组：ICAM-1表达的平均光密度为0.782±0.0236，假手术组：ICAM-1表达的平均光密度为0. 831±0.0258，缺血再灌注损伤组：ICAM-1表达的平均光密度为3.135±0.1595；当归治疗组：ICAM-1表达的表达的平均光密度为0.804±0.0244；正常对照组：ICAM-1表达的阳性面积率为0.237±0.0216，假手术组：ICAM-1表达的阳性面积率为1.379±0.0327，缺血再灌注损伤组：ICAM-1表达的阳性面积率为1.379±0.0327；当归治疗组：ICAM-1表达的表达的阳性面积率为0.258±0.0138。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05)。经q 检验，正常对照组、当归治疗组、 假手术组与缺血再灌注损伤组之间ICAM-1的平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；正常对照组与假手术组之间、当归治疗组与假手术组之间ICAM-1平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。见表1。表1 当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后各组ICAM - 1表达的平均光密度和阳性面积率(略)注：* 正常对照组、假手术组、当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较，P＜0.001；△ 当归治疗组、假手术组与正常对照组比较，P＞0.05。
3 讨论
缺血再灌注损伤的影响因素很多, 如缺血时间的长短, 灌注液的成分、温度和压力, 缺血组织器官状态等。不同组织细胞对缺血的耐受程度不同, 再灌注损伤的产生也存在差异。根据缺血再灌注时间的不同, 其对心肌的影响是多方面的。缺血时间短(小于5min) 心肌处于可逆的损伤, 当恢复再灌注后缺血心肌的功能可以迅速恢复正常；预先短暂缺血和再灌注可以减轻后续较长时间缺血造成的损伤, 即心肌缺血的预适应( ischemic precondition, IPC) 现象；较长时间缺血(通常是5～20min)尚不足以引起心肌功能、形态改变,但再灌注后可能表现为心律失常(arrhythmia)和心肌顿抑(myocardialstunning),后者是指心肌功能的可逆、延迟性抑制［5］；更长时间的心肌血供完全中断(大于30min),则造成心肌细胞不可逆性损伤、坏死, 即心肌梗死(myocardial infarction)；慢性心肌缺血供血不足,当血供恢复正常后,心肌功能可部分或全部恢复正常, 即心肌冬眠(myocardial hibernation)。心肌在缺血后数秒钟内即可出谢和功能的变化, 并随着时间的推移呈进行性加重。心肌缺血早期造成的损伤是可逆的, 随着缺血时间的增加, 损伤变得更为严重,最终导致不可逆性损伤、坏死。缺血时间越长,可逆性损伤的细胞数越少, 再灌注后可能恢复正常功能的组织越少［6］。心肌缺血再灌注损伤的发病机制尚未完全阐明,目前的研究认为,心肌缺血再灌注导致线粒体能量合成障碍、Ca2+ 稳态紊乱和大量自由基产生,最终导致细胞凋亡或死亡［7］。
当归含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等。目前已证明,当归对心血管系统、血液造血系统、免疫系统、抗氧化和清除自由基等多方面均有肯定的药理作用。在心血管疾病中,经常发生缺血再灌注损伤,其机制可能是多因素的,但主要有三个环节:即能量代谢失常、钙超载和氧自由基生成,其中氧自由基是造成缺血再灌注损伤的直接原因［8］ 。缺血再灌注过程中,机体可通过多种途经产生氧自由基,氧自由基与生物膜发生一系列反应,可破坏心肌细胞结构、损伤心肌细胞膜, 产生大量的脂质过氧化物。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤慨念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但巳经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。
ICAM-1作为白细胞功能相关抗原、巨噬细胞分化抗原-1的配体,参与白细胞与血管内皮细胞的黏附并向血管外迁移,黏附心肌细胞释放细胞毒, 表达增强的ICAM-1还可反馈作用于内皮细胞、巨噬细胞,促进细胞因子的炎症介质的表达。ICAM-1在内皮及心肌细胞中的诱生对中性白细胞介导的缺血再灌注损伤至关重要［8］。国外研究发现, 心脏缺血再灌注损伤中ICAM-1表达明显升高, 且与心肌损伤密切相关［10］。本实验数据表明,缺血再灌注损伤模型中ICAM-1含量明显增加。当归治疗组中ICAM-1含量明显降低，表明当归可下调心肌组织中ICAM-1水平,对心肌起了重要的保护作用。同时说明当归可抑制心肌缺血再灌注时内皮细胞合成释放细胞因子等炎症介质,减轻心肌损伤。
心肌缺血再灌注损伤的机制研究已取得了很大的进展, 随着分子生物学、药学等相关学科实验技术的, 人们将会对心肌缺血再灌注损伤的机制有更深刻的认识, 找到更安全、有效的治疗措施及治疗药物。相信在广大医药工作者的不断努力下,将会在祖国中医药宝库中发现对心肌缺血再灌注损伤有更好保护作用的药物。
本实验结果为临床防止缺血再灌注损伤提供了一个新的思路,其确切临床价值有待于进一步的研究和证实。
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