Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实验研究

                 作者：邱文洪 郭凯文 宋文剑 沈关心  

【摘要】  探讨RNA干扰技术抑制Survivin对人胰癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响。方法： 体外设计、合成针对survivin基因的小分子干扰RNA(survivin-siRNA)，应用脂质体介导survivin-siRNA转染Panc-1细胞后，MTT试验测定转染细胞的增殖抑制率，RT-PCR检测细胞survivin mRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞凋亡诱导作用。结果： 转染survivin-siRNA的Panc-1细胞增殖明显受抑制，与对照进行比较，具有显著性差异（P<0.01）；经琼脂糖凝胶电泳，转染survivin-siRNA的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带，而对照细胞未见到。结论：survivin-siRNA能够显著诱导Panc-1细胞凋亡。

【关键词】  siRNA survivin Panc-1 凋亡

　　The Study of siRNA of Survivin Gene Induced Apoptosis in Panc-1 Cell Line in Vitro  Qiu Wenhong，et al(Department of Immunology, College of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056)Abstract  Objective： To explore the effects of surviving-siRNA on induced apoptosis in human pancreatic cancer cell line Panc-1. Methods: The small interference RNA （siRNA） targeting survivin gene was designed and synthesized by transcription in vitro. Survivin siRNA was transferred into Panc-1 cell line by lipofection. The opposite livability on Panc-1 cell line was assayed with MTT test. Expression of survivin was detected by RT-PCR. Apoptosis was detected by DNA gel electrophoresis. Results: Survivin siRNA obviously inhibited the Panc-1 cells growth (P<0.01). Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from Survivin siRNA transferred Panc-1 cells showed typical DNA ladder, but DNA from other cells did not. Conclusion: Survivin siRNA could effectively induce apoptosis in Panc-1 cells.
   
　　Key words   siRNA ；Survivin;  Panc-1 cell line； Apoptosis

    生存素（Survivin）是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族新成员。它作为一种新的凋亡抑制因子，其组织分布和作用机制的独特性已引起国外学者的广泛关注［1］。深入研究RNA干扰技术的作用将为人胰腺癌的基因提供一种较有效的方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

    Panc-1细胞本室保存；脂质体LipfectamineTM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自SantaCruz公司；Taq DNA聚合酶，逆转录试剂盒购自MBI公司；RPMI1640培养基，TRIzol RNA分离试剂盒购自GIBCO公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自Beytime Biotechnology公司。

　　1.2  设计survivin特异性siRNA

    根据survivin基因在GenBank中的序列，应用美国Ambion公司的设计软件设计相应的siRNA，同时在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性，人工合成针对740～761nt位碱基靶序列的两条寡核苷酸链模板。

　　1.3  合成survivin特异性siRNA

    稀释上、下游模板，终浓度均为100μmol/L，分别与T7启动子序列连接，70℃5min，室温5min，37℃延伸30min，体外转录，37℃2h，siRNA的正、反义RNA结合，37℃过夜，去除前导序列和DNA模板，37℃2h，用层析方法纯化siRNA。测定合成的siRNA 260nm的吸光度(A)值，定量后-70℃保存。

　　1.4  细胞转染

    采用常规方法培养Panc-1细胞，取对数期生长的细胞用于实验。将处于对数生长期的Panc-1细胞接种于6孔板，当细胞融合达70%，按照lipofectamine2000试剂盒说明书将survivin特异性siRNA（survivin-siRNA）转染Panc-1细胞。同时转染GAPDH特异性的siRNA（GAPDH-siRNA）作对照。

　　1.5  采用MTT法检测细胞增殖抑制实验

    转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。24ｈ后应用MTT法，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(Ａ)值，每个浓度设3个复孔，肿瘤细胞抑制率=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。

　　1.6  转染细胞survivin mRNA表达的检测

    转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。按照试剂盒说明提取总RNA逆转录成cDNA，进行PCR反应检测survivin mRNA的表达。引物序列为，上游引物：5-CATGGGTGCCCCGACGTT-3'，下游引物：5-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3'，并以β-actin为内参照，扩增片段长度313 bp。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min、50℃退火45s、72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min。产物经20ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。

　　1.7  采用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡

    转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。洗涤并重悬，加入细胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，50℃孵育2h，再加入RNase A室温放置1h。酚、氯仿抽提，取10μl DNA， 70℃放5min后，15ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶，4V/cm电泳3h，观察结果并照相保存。

　　1.8  统计学方法

    以上实验重复3次，部分数据以平均数±标准差(±s)表示，采用SAS 软件进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  Survivin-siRNA对Panc-1细胞增殖的抑制

    脂质体介导的Survivin-siRNA转染Panc-1细胞后，MTT法检测Survivin-siRNA对Panc-1细胞增殖的影响。表1结果显示：Survivin-siRNA对Panc-1细胞的增殖抑制明显，GAPDH-siRNA对照组和未转染空白对照组不能对细胞产生明显的抑制作用。表1   Survivin反义寡核苷酸对Panc-1细胞增殖的影响（略）注：与各对照组比较，P<0.01。

　　2.2  Survivin-siRNA对Panc-1细胞 survivin mRNA表达的影响

    转染48h后，RP-PCR产物的DNA电泳结果显示，空白对照组和GAPDH-siRNA处理组在430bp处均出现特异性的Survivin条带(图1)。Survivin-siRNA组和对照组的Survivin/β-actin分别为0.32±0.07和0.98±0.04，两者之间差异具有显著意义（P<0.01）。Survivin mRNA比对照组下降了3.06倍。

　　2.3  Survivin-siRNA诱导Panc-1细胞DNA片段的变化

    转染48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2显示：脂质体介导的Survivin-siRNA转染的Panc-1细胞，15ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶电泳即可看到DNA梯形条带，而脂质体介导的GAPDH-siRNA转染的Panc-1细胞和空白对照组一样，DNA电泳均显示分子量很大的一条带，未见到DNA梯形条带。这反映了Survivin特异性siRNA作用Panc-1细胞时导致了不同于坏死的DNA降解。

　　3  讨论

    人胰腺癌是一种多基因控制疾病，其发生和多种癌基因的激活与抑癌基因的失活及细胞增殖和凋亡(apoptosis)调节失控密切相关［2］。近年研究发现凋亡蛋白抑制因子(Inhibitors of apoptosis protein, IAPs)家族在凋亡的基因调控中发挥重要作用［3］。定位于人染色体17q25的survivin基因是IAPs家族在哺乳类动物中的同系物。与其他IAPs因子不同，survivin仅表达于胚胎发育组织，在分化的正常组织中沉默，但特异性地表达于包括人口腔上皮癌在内的人类绝大多数肿瘤组织。据此，我们认为survivin可能是人口腔上皮癌选择性的理想靶标。由于RNA干涉（RNAi）技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法。它能在特定位点，特定间隔降解与siRNA序列相应的mRNA，从而高效阻断基因的表达，可以实现细胞水平的基因敲除［4］。因而设想通过人工合成survivin特异性siRNA抑制survivin基因的表达，诱导Panc-1细胞凋亡，期望为临床人口腔上皮癌的治疗开辟一条新途径。

    本实验中，我们应用脂质体介导的survivin特异性siRNA转染Panc-1细胞，可明显降低Panc-1细胞survivin mRNA的表达，对胰癌Panc-1细胞增殖的抑制明显，可明显诱导细胞发生凋亡。实验结果证明特异性靶向survivin的siRNA可明显抑制Panc-1细胞的增殖并诱导细胞凋亡。

    因此应用survivin-siRNA的靶向治疗，能够阻止肿瘤的发生、发展，使survivin特异性siRNA在人胰腺癌的治疗上，成为一种较有效的方法。

【】
  　　1 Chiou SK, Jones MK, Tarnawski AS. Survivin an anti-apoptosis protein: its biological roles and implications for cancer and beyond. Med Sci Monit, 2003, 9(4):PI25~29.

　　2 Shore S, Raraty MG, Ghaneh P, etal. Review article: chemother-apy for pancreatic cancer. Aliment Pharmacol Ther. 2003 Dec;18(11~12):1049～1069.

　　3 Wrzesien-Kus A, Smolewski P, Sobczak-Pluta A, et al. The inhibitor of apoptosis protein family and its antagonists in acute leu- kemias.Apoptosis. 2004 Nov;9(6):705~715.

　　4 Rosel KF, Georg S. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res, 2003, 31: 4417~4424.