N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织水通道蛋白表达的研究

【摘要】  目的： 观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对急性肺损伤(ALI)肺组织水通道蛋白-1的表达,进一步探讨N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤(ALI)肺组织的保护作用。方法： 应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用N-乙酰半胱氨酸进行干预。实验设对照组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组，在肺损伤模型成功后24 h处死大鼠,取左叶肺组织。采用免疫组化染色, 检测N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白-1 (AQP-1)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： 实验对照组肺组织表达高水平AQP-1；模型组肺组织呈浅黄色染色, AQP-1表达较低；N-乙酰半胱氨酸组肺组织表达高水平AQP-1。经q 检验，实验对照组与模型组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，实验对照组与N-乙酰半胱氨酸组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率差异无显著性(P＞0.05)。结论： N-乙酰半胱氨酸能使急性肺损伤组织中AQP-1呈高表达，对急性肺损伤组织有重要的保护作用。

【关键词】  N-乙酰半胱氨酸 肺损伤 水通道蛋白-1

  
　　急性肺损伤(ALI)的显著特征是大量富含蛋白的渗出液流入到肺泡腔,严重影响肺的换气功能,导致低氧血症、呼吸衰竭,病死率高达30%~40%［1］。目前认为,以炎性细胞因子大量释放为特征的过度全身炎症反应是ALI的主要发病基础,并伴有纤维组织增生［2］。但发病机制仍不十分清楚，因此给临床带来诸多问题。

    NAC是左旋精氨酸的天然衍生物,是一种含活性巯基化合物［3］。近年国内外大量实验研究结果已经证明,NAC具有强大的抗氧化和细胞保护作用。但有关NAC对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用NAC进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白(AQP)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率,进一步探讨NAC在防治急性肺损伤中的作用机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物模型制备及分组

    健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）, 清洁级（SPF），平均体重(180±35)g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h, 自由饮水。实验分组分为3组：实验设对照组（注射等量生理盐水，n=20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，n=20)、NAC组（于尾静脉注射LPS前1 h分别经腹腔注射NAC(200 mg/kg)，n=20）。

　　1.2  动物标本制备

    将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作，取材时间为LPS注射后24h(T24)。主要试剂：① 浓缩型兔抗鼠水通道蛋白-1多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司)；② 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；③ 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.2  主要仪器

　　YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。

　　1.3  方法

　　1.3.1  常规HE染色 

　　取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　1.3.2  免疫组织化学S-P法检测AQP-1相关抗原
 
    主要步骤：

    ① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；

    ② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；

    ③ AQP-1采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min；

    ④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；

    ⑤ 一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；

    ⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

    ⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；

    ⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

    用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3.3  免疫组织化学结果判断 
    
　　AQP-1相关抗原以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
   
　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对AQP-1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定AQP-1每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。

　　1.4  统计学处理

    对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果

    对照组肺组织中AQP-1呈高表达,可见肺组织内分布棕黄色颗粒。模型组肺组织AQP-1呈低表达 ,可见肺组织内有少量的棕黄色颗粒；NAC组肺组织中AQP-1呈高表达,可见肺组织内分布棕黄色颗粒。图像分析结果显示：对照组AQP-1表达的平均光密度为  0.3751±0.0572；模型组AQP-1表达的平均光密度为0.1697±0.0327；NAC组AQP-1表达的平均光密度为0.3573±0.0489。对照组AQP-1蛋白表达的阳性面积率0.2984±0.0452：模型组AQP-1表达的阳性面积率为0.0986±0.0371；NAC组AQP-1表达的阳性面积率为0.2758±0.0453。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01﹚。经q 检验，对照组与模型组，模型组与NAC组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，对照组与NAC组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05) 。见表1。表1  对照组、模型组及NAC组AQP-1表达的平均
光密度和阳性面积率（略）注：*  对照组与模型组比较，P＜0.01；#  模型组与NAC组比较，P＜0.01；△  NAC组与对照组比较，P＞0.05。

　　3  讨论

    急性肺损伤（Acute lung injury， ALI） 是临床常见危急重症，晚期常并发多脏器功能障碍综合症（MODS），由于缺乏有效的方法，已成为重症监护室（ICU）中死亡的主要原因之一［4］。ALI病因各不相同，发病机制复杂。ALI是严重感染、创伤、休克等导致的以肺泡毛细血管膜损伤为基础，渗透性肺水肿和微肺不张为特征，临床表现为急性呼吸窘迫和顽固性低氧血症的综合征。LPS是内毒素的主要成分，存在于革兰氏阴性细菌的胞壁外膜［5］，是介导全身炎症反应的重要物质，它不仅可通过刺激炎症效应细胞(单核/巨噬细胞、多形核白细胞、内皮细胞、血小板等)产生炎症介质和细胞因子，还可直接损伤靶细胞。

    NAC是左旋精氨酸的天然衍生物,分子式为C5H9NO3S,是一种含活性巯基化合物。近年国内外大量实验研究结果已经证明,NAC具有强大的抗氧化和细胞保护作用。NAC可通过两种机制发挥其抗氧化功能:通过发挥还原型谷胱甘肽(GSH)前体即半胱氨酸的功能间接起到抗氧化作用,这是NAC发挥抗氧化作用的主要机制［6］;同时,NAC还可以通过提高白细胞内还原巯基水平,抑制白细胞激活和炎症介质的产生,保护抗蛋白酶免于被氧化失活［7］。NAC本身也是一种直接的抗氧化物质,通过自身巯基的氧化来还原生物大分子中的二硫键,从而保护生物大分子的活性,NAC还可以通过补充细胞内的GSH发挥细胞保护作用。

    水通道蛋白（Aquaporin，AQPs）是一组糖蛋白,分子量约30000 左右,属古老的跨膜通道蛋白MIP(majorintrinsic protein) 家族成员,选择性地分布在那些与体液吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同液体跨细胞转运的内皮细胞中,执行着各部位的水分重吸收、液体分泌和细胞内外水平衡功能［8］。到目前为止已克隆的哺乳动物水通道蛋白家族有11个成员(AQP0-AQP10), 肺组织中的AQP有6种,即AQP1、3、4、5、8和9［9］,其中AQP-1及AQP4表达最多。上世纪90年代以后的大量研究证实,细胞代谢过程中所需要的水主要是通过AQPs对水分子的高度选择性来完成跨膜转运的。不同的细胞和组织内AQPs参与在生理和病理条件下细胞内外水的即刻分布［10］。由于水转运发生的细胞体积变化而引起的质膜扩展或收缩,可激活质膜上的机械性门控离子通道或机械性受体,继而激活某些信号的传导,调整细胞的液体转运［11］。有报道［12］,细胞死亡时最早的事件是细胞内水经水通道的外溢,推测AQPs的功能与细胞凋亡有密切关系。因此,AQPs表达或功能的改变不仅对水分子的传输产生明显影响,而且对细胞的生命活动也至关重要。AQP-1是第一个发现的水通道蛋白,几乎在全身各处都有分布。毛细血管内皮是毛细血管间水转运的主要障碍,Verkman［13］研究发现如小鼠肺毛细血管内皮缺乏AQP-1 ,肺泡毛细血管间水的渗透力可下降90% ,证实呼吸道中水通过毛细血管运输主要由AQP-1介导。

    本研究采用免疫组织化学显示AQP-1在对照组肺组织中呈高表达, 模型组肺组织AQP-1呈低表达, NAC组肺组织中AQP-1呈高表达。实验结果表明，对照组AQP-1呈高表达说明,证实AQP-1可以使水快速通过毛细血管内皮细胞进入周围的组织液中,调控细胞间液体量和血管容积的流体静压与胶体膨胀压,满足肺上皮细胞代谢需要,对维持肺的正常生理功能具有重要作用；模型组肺组织AQP-1呈低表达, 由此推测ALI病理过程中,AQP-1表达下调,肺泡毛细血管间水转运障碍,导致液体在肺泡腔、肺间质的积聚,从而使肺泡腔、肺间质水肿加重,可能参与了肺水肿时液体的异常转运。结果提示肺损伤后AQP-1在调节肺内液体平衡中起一定作用,可能参与了ALI肺水肿的发病机制。NAC组肺组织中AQP-1呈高表达，结果提示NAC可以抑制活性氧所引起的中性粒细胞与血管内皮细胞上某些黏附分子,如血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的过度表达,减少中性粒细胞在肺脏的浸润,抑制其对肺损伤的作用，从而达到保护受损的肺组织。

【文献】
  　　1 Ware L B, Matthay M A. The acute respiratory distress syndrome.N Engl J Med,2000,342(18):1334~1349.

　　2 李燕芹,吕寒冰,方马荣,等.急性肺损伤时肺部纤维化及血管生成状态的研究.危重病急救医学,2004,16(11):677~678.

　　3 周长福,李志军,刘红栓.血必净联合前列腺素E1对肺纤维化大鼠转化生长因子-β1的影响.中国中西医结合急救杂志,2007,14(3):186.

　　4 余维巍,刘晓晴.肝细胞生长因子在急性肺损伤中的修复作用.中国急救医学,2005,25(6):444~445.

　　5 Jablonski E M , Webb A N , McConnell N A , et al. Plasma membrane aquaporin activity can affect the rate of apoptosis but is inhibited after apoptotic volume decrease. Am J Physiol Cell Physiol,2004,286: 975~985.

　　6 Ortolani O,Conti A,De Gaudio A R,et al.Protective effects of N-acetylcysteine and rutin on the lipid peroxidation of the lung epithelium during the adult respiratory distress syndrome.Shock,2000,13(1):14~18.

　　7 Leme A S,Lichtenstein A,ArantesCosta F M,et al.Acute lung injury in experimental pancreatitis in rats: pulmonary protective effects of crotapotin and N-acetylcysteine. Shock, 2002, 18(5): 428~433.

　　8 关桂梅,董震,吕梅. 鼻息肉组织嗜酸粒细胞中水通道蛋白2和抗凋亡基因Bcl-2mRNA的表达及意义. 中华耳鼻咽喉科杂志,2004 ,39 (10) :476~478.

　　9 李志海,高起学. 水通道蛋白2 、5 在人鼻息肉组织中的表达. 临床耳鼻咽喉科杂志, 2005 , 19 (4) :162~164.

　　10 Agre P ,Kozono D. Aquaporin water channels : molecular mechanisms for human diseases. FEBS Lett , 2003 ,555 :72~78.

　　11 Lee M D , King L S , Nielsen S , et al. Genomic organization and developmental expression of aquaporin in lung. Chest ,1997 ,111 :111S~113S.

　　12 King L S , Yasui M , Agre P. Aquaporins in health and disease. Mol Med Today , 2000 ,6 :60~65.