超声提取夏枯草中总三萜类成分的研究

                  作者：吕杏放 朱文斌 杨倬荣 周杨 黄春瑜 彭新生

【摘要】  　　目的：探讨夏枯草中总三萜类成分的提取工艺。 方法：采用正交试验设计方案优化夏枯草中总三萜类成分的超声提取工艺。结果：最佳提取工艺为提取温度65℃，85％乙醇，超声30min，10倍溶剂用量，超声提取3次。结论：超声提取既简便又高产，节能且环保。

【关键词】  超声提取 总三萜类 夏枯草 熊果酸

　　夏枯草是唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris Linn．的干燥果穗或全草，别名夏至草、夏枯头。在我国主产于江苏、浙江、安徽和济南等地，主要化学成分为三萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类、糖类和挥发油类等［1］，具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，临床用于甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病［2］。夏枯草属植物中含有多种三萜类成分, 主要为齐墩果烷型、乌苏烷型和羽扇豆烷型三萜。其药理活性成分熊果酸（UA）、齐墩果酸（OA）等三萜类化合物具有镇静、抗炎、抗菌、抗高血压、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应［3］。近年来研究发现，三萜类中的熊果酸（UA）具有抗致癌、抗促癌、诱导F9畸胎瘤细胞分化和抗血管生成作用，极有可能成为低毒高效的新型抗癌药物［4］；齐墩果酸（OA）具有保肝、免疫作用［5］。本实验采用正交试验设计，以夏枯草中总三萜类成分的含量为评价指标，考察乙醇为溶剂用超声提取的最佳工艺条件。

　　1  仪器与试药
    
　　KQ 5200 DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UV-1800紫外-可见分光光度仪（上海美谱达仪器厂）；TGL-18G高速台式离心机（湖南星科仪器公司）；WK-1000A高速药物粉碎机（山东青州市精诚机械有限公司）。
    
　　夏枯草（干燥花序、果穗）购于广东东莞国药集团有限公司，经苟占平副教授鉴定为夏枯草属植物夏枯草(Prunella vulgaris Linn)。
    
　　熊果酸标准品购于药品生物制品检定所。活性炭（C.P），其余试剂均为A.R。

　　2  实验方法

　　2.1  夏枯草超声提取正交试验设计方案

　　2.1.1  因素水平  试验选择以下4个因素：乙醇浓度（A）、超声温度（B）、提取时间（C）、溶剂用量（D）作为考察对象，每个因素取3个水平（表1），以提取物中总三萜类成分含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行正交试验设计。

　　表1  因素水平表（略）

　　2.1.2  夏枯草预处理  取干燥的夏枯草（花序﹑果穗）若干，粉碎成粗粉，干燥。

　　2.1.3  供试品溶液制备  准确称取9份夏枯草粉末，每份2.00g，分别置圆底烧瓶中，加入相应浓度和体积的乙醇，置超声器中提取，趁热抽滤；滤渣再次加入相应浓度和体积的乙醇，置超声器中提取；共超声提取3次，每次操作的条件和步骤一致，合并3次滤液，置于旋转回流蒸发仪中，60℃水浴浓缩蒸干所有溶剂。样品浓缩后，加无水乙醇（约15ml）超声溶解，过滤，加活性炭脱色并于70℃水浴15min，趁热过滤，加无水乙醇定容至25ml,取10ml样品溶液离心（4000r/min,20min）。离心后取上层澄清液5ml于25ml容量瓶，加无水乙醇定容至刻度，作为供试液备用。

　　2.2  测量方法的研究

　　2.2.1  对照品溶液的制备  准确称取熊果酸标准品20.00mg至容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为80.00  g／ml的对照品溶液。

　　2.2.2  选择显色条件  采用L9（34）正交表设计正交试验：0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml的5％香草醛-冰醋酸（A）；0.80 ml、1.00 ml、1.20 ml的高氯酸（B）；50.0 ℃、60.0℃、70.0 ℃的水浴温度（C）；10.0 min、15.0 min、20.0 min水浴时间（D）。用对照品溶液显色，以吸收度数值为检测指标，得出最佳显色条件为：5.0％香草醛-冰醋酸溶液0.30ml，高氯酸1.00ml，60℃水浴10min。

　　2.2.3  最大吸收波长的选择  精密吸取1.00ml熊果酸对照品溶液，用最佳显色条件显色。对显色体系在500nm～600nm波长范围内扫描，结果表明：在546nm处显示最大吸收，且空白无干扰，故选546nm为测定波长。

　　2.3  方法学考察［6，7］及含量测定

　　2.3.1  线性关系考察  精密吸取熊果酸对照品溶液（80.00  g／ml）0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10ml置带塞刻度试管中，100℃水浴挥干溶剂，加5.0％香草醛-冰醋酸溶液0.30ml，高氯酸1.00ml，60℃水浴10min，冰浴冷却，加冰醋酸5.00ml，摇匀，在546nm处测定吸收值，以熊果酸的微克数为横坐标，吸收度测定值为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析。

　　2.3.2  稳定性考察  精密吸取熊果酸对照品溶液0.60 ml，浓度为80.00  g／ml。在显色冰浴冷却后开始计时，于20min～80min分钟内测定。

　　2.3.3  重现性考察  精确称取干燥至恒重的夏枯草粗粉5份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按最佳显色条件显色，于稳定范围内测定吸收度。

　　2.3.4  含量测定  精确称取干燥至恒重的夏枯草粗粉3份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按最佳显色条件显色，于稳定范围内测定吸收度。以吸收度值为考察指标，药材中总三萜类成分的含量。

　　2.3.5  回收率试验  分别精密吸取熊果酸对照品溶液（80.00  g／ml）置5支带塞刻度试管中，各0.50ml，各精确加入称取的干燥至恒重夏枯草粗粉，然后按2.1.3项下方法平行操作，按最佳显色条件显色，于稳定范围内测定吸收度，按标准曲线进行测定分析。

　　2.4  结果

　　2.4.1  线性关系考察结果
    
　　回归方程为：y＝0.0058x＋0.0099，R2＝0.9936，在39.33 g～86.22 g范围内呈良好线性关系。

　　2.4.2  稳定性考察结果
    
　　稳定性考察结果为在显色后30至60min内稳定，见表2。

　　表2  稳定性考察表（略）

　　2.4.3  重现性考察结果
    
　　重现性考察得样品平均浓度为56.15  g／ml，RSD＝1.37%（n＝5），重现性良好。见表3。

　　表3  重现性考察表（略）

　　2.4.4  总三萜成分得率与数据分析
    
　　正交试验结果数据分析，见表4、5。

　　表4  正交试验结果与分析（略）

　　表5  正交试验结果的方差分析（略）

　　注：* P<0.05。
    
　　由表5分析可知，夏枯草中总三萜类成分最佳提取工艺为：A3B3C2D3。对夏枯草中总三萜类物质含量影响因素主次顺序为：B>A>C>D，即超声温度    65℃，85％乙醇，超声30min，10倍溶剂用量。

　　2.4.5  验证实验  以A3B3C2D3最佳工艺进行3次重复实验，测得夏枯草中总三萜类成分平均含量为3.497％。RSD＝0.824％，见表6。

　　表6  夏枯草总三萜类物质含量测定（略）

　　2.4.6  回收率试验结果  用最佳提取工艺即提取温度65℃，85％乙醇，超声30min，10倍溶剂用量提取出来的供试品溶液进行回收率试验，得出平均回收率＝98.65％，RSD＝1.73％。见表7。

　　表7  回收率试验（略）

　　3  讨论
    
　　在预试验中发现，提取3次总三萜类成分含量为65.71μg，提取2次总三萜类成分含量为49.67μg。提取3次的含量远高于提取2次的含量，故选定工艺提取次数为3次。
    
　　冰醋酸-香草醛、高氯酸比色法是测定三萜类化合物常用方法，本法测定的机制可能是三萜酸本身在可见光区无吸收，经过三萜酸中羟基与香草醛结构中的醛基进行缩合反应，生成紫红色的缩合物，通过测定缩合物的量，从而出总三萜类物质的量。在0.30ml 5％香草醛-冰醋酸溶液，1.00ml高氯酸，60℃水浴10min的条件下显色，从实验中知在显色后30～60min内稳定，有一个较准确的测定值。若在实验中严格控制反应条件，其结果稳定且重现性好，可用于质量控制［8］。
    
　　通过回收率试验验证，最佳提取工艺对于夏枯草中总三萜类成分提取较完全，平均回收率为98.65％。
    
　　利用本实验探讨的提取方法可从夏枯草药材中大量提取总三萜类物质，为医药领域和生产提供广阔前景。

【】
  　　1 刘悦,宋少江,徐绥绪.夏枯草的化学成分及生物活性研究进展.沈阳药科大学学报，2003,20(1):55～59.

　　2 王祝举,赵玉英,陈雅妍,等.夏枯草属植物化学成分和药理活性.国外医药·植物药分册,2001,16(1):7～9.

　　3 付晓瑞,李继昌,张明智.夏枯草近代研究进展概述.中医研究，2005，18(6)：60～62.

　　4 黄镜,孙燕.熊果酸的抗肿瘤活性.新药杂志,1997,6(2):101～104.

　　5 商敏凤.齐墩果酸药理研究概况.北京医药,1992,11（4）:29～31.

　　6 谢莹,杭太俊,程赞，等.高效液相色谱法测定中药中齐墩果酸和熊果酸含量.中国中药杂志,2001,26(9):615～616.

　　7 郝润喜,阎彩萍,孙晓飞，等.山楂中熊果酸的高效液相色谱分析.药物分析杂志，1994,14(4):30～31.

　　8 黄秀香,袁霞,林翠梧,等.分光光度法测定毛老虎茎中三萜酸的总含量.时珍国医国药,2007,18(2):297～298