高效液相色谱法测定蛹虫草子实体中腺苷的含量
【摘要】 目的 建立测定蛹虫草子实体中腺苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相:水?甲醇（体积比85∶15），流速:1.2 mL/min；检测波长:260 nm。 结果 腺苷平均加样回收率为100.23％，RSD=1.43%。结论 该方法简便、准确，适用于该产品质量检验分析。
【关键词】 高效液相色谱法；蛹虫草子实体；腺苷
Abstract:Objective To establish an HPLC method for content determination of adenosin in Cordyceps militaris(L.) Link. Methods Samples were analyzed on a DiamonslTM C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) by using water?methanol (85∶15) as mobile phase. The detection wavelength was 260 nm. Results The average recovery of adenosine was 100.23% with RSD=1.43%. Conclusion The method is simple, accurate, which can be used for the quality control of Cordyceps militaris (L.) Link.
Key words:HPLC; Cordyceps militaris (L.) Link; adenosine
蛹虫草(又名北虫草、北冬虫夏草)子实体为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌Cordyceps. militaris( L. ) Link.的干燥子座,是虫草属的模式种，也是与冬虫夏草极为相似的种。
研究资料表明，蛹虫草子实体的活性成分与野生冬虫夏草类似，含有多量的虫草素、腺苷、腺嘌呤、虫草酸、虫草多糖等［1-3］。有报道，腺苷可减少心肌漏出酶,维持细胞膜的完整性并降低冠脉阻力,对心肌有一定的保护作用［4-6］。目前，蛹虫草子实体的质量多以测定其多糖的含量作为控制标准，多糖测定使用硫酸酚法，操作误差大，条件不易把握。鉴于腺苷为蛹虫草中的活性成分之一,本文采用高效液相色谱法测定了蛹虫草子实体中腺苷的含量,方法灵敏，结果准确可靠。
1 仪器与材料
1.1 仪器
日本岛津高效液相色谱仪ClassLC?IOA型，SPD?10A紫外检测器， N2000色谱工作站；sartorius BS423S型天平；超声波清洗器(天津恒奥超声波清洗器)。
1.2 材料
腺苷对照品（药品生物制品检定所检定，批号：879?200102）；蛹虫草子实体，购于江门市新会会城汇康虫草制品厂；甲醇为色谱纯；水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱DiamonsilTM C18（ 4.6 mm×250 mm,5 μm ）；流动相：水?甲醇（体积比85∶15）为流动相。流速1.2 mL/min；检测波长：260 nm；进样量：20 μL；柱温：室温25 ℃。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取干燥至恒重的腺苷对照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加体积分数为90%的甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含0.2 mg对照品的溶液，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液的制备
称取蛹虫草子实体样品适量，粉碎，过2号筛，备用。精密称取10 g供试品粉末，置500 mL圆底烧瓶内，加入体积分数为50%的乙醇水溶液100 mL，置沸水浴中回流提取1 h，取出过滤，共提取3次，滤液合并后蒸干，加体积分数为50％的甲醇溶解定容至100 mL容量瓶，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜压滤，得供试品溶液。
2.4 最大吸收波长的选择
取腺苷对照品和供试品溶液适量，加体积分数为90%的甲醇溶解，用紫外—可见分光光度计于200～400 nm波长范围扫描。腺苷对照品和供试品溶液均在260 nm处有最大吸收。结果同《中国药典》中“冬虫夏草”腺苷的最大吸收波长一致。因此确定测定波长为260 nm。
2.5 线性关系的考察
精密吸取0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL的腺苷对照品溶液（每1mL中含0.2 mg对照品），分别置10 mL的容量瓶中，用体积分数为90％的甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液，在上述色谱条件下，分别注入液相色谱仪(进样量20 μL)。以质量浓度为横坐标(ρ, mg/mL),峰面积(A)为纵坐标,绘制标准曲线。经回归处理后得标准曲线：A＝704720ρ＋98845（R2=0.9996），说明腺苷在82.56～206.4 μg范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
取16 μg/mL的对照品溶液，每次进样20 μL，连续进样5次，测定峰面积，腺苷峰面积RSD为0.41%（n=5）。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液20 μL，分别于放置0、2、4、6、8 h进样测定，结果供试品溶液在8 h内峰面积无明显变化，峰面积RSD为0.66%。
2.8 加样回收率试验
采用加样回收法, 取已知含量的同一批供试品粉末约10 g,共5份，分别精密称定，置圆底烧瓶中，再分别精密加入“2.2”项下腺苷的对照品溶液1 mL，再加入体积分数为50%的乙醇100 mL, 按“2.3”项下方法制备溶液,进样测定，回收率，结果见表1。
表1 腺苷加样回收率试验（略）
Tab.1 Results of recovery test
2.9 样品的测定
取5个不同批次的样品各10 g,分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，每个样品测5次，结果5个批号样品的腺苷含量分别为1.86、1.962、1.918、2.067、2.018 mg/100 mL。腺苷对照品与样品色谱图见图1、图2。
图1 腺苷对照品色谱图（略）
Fig.1 HPLC spectrum of adenosine
图2 样品色谱图（略）
Fig.2 HPLC spectrum of the sample
3 讨论
3.1 流动相的选择
曾采用《药典》2005年版一部“冬虫夏草”项下磷酸盐缓冲液(pH 6. 50)?甲醇( 体积比17∶3) 为流动相进行洗脱，结果发现腺苷色谱峰展宽严重，且主峰附近存在干扰峰。经反复实验摸索,调节流动相水?甲醇体积比为85∶15时,采用本文的检测方法产生的色谱峰峰形尖锐，供试品中其他杂质峰对两个主峰测定无干扰。经方法学考察，本文检测方法的精密度、重现性、稳定性均良好。
3．2 提取溶剂的选择
曾采用蒸馏水、体积分数为50%的乙醇、无水乙醇、体积分数为50%的甲醇进行提取溶剂对照试验，实验结果表明：体积分数为50%乙醇即可基本提取完全。在制备腺苷对照品储备液时，曾采用双蒸水、无水甲醇、体积分数分别为50%和90%的甲醇作溶剂，腺苷在以上溶剂均可溶解，以在双蒸水中溶解速度最快；上高效液相色谱仪进行对比，又以在体积分数为90%甲醇中的峰形较对称，效果最佳。
3．3 溶液的稳定性试验表明，腺苷供试品溶液在室温下24 h内基本稳定，但色谱峰峰面积有逐渐降低的趋势，可能是降解所致。故对照品溶液和供试品溶液均不宜久贮。
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