人参皂苷Rb3对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

                    作者：胡瑜，陈浩凡，臧林泉，巫玮

【摘要】  目的 探讨3种人参皂苷Rb3对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。 方法 将48只大鼠随机分成6组：假手术组、模型组、人参皂苷Rb3 20、40、80　mg/kg组和阳性对照药血栓通注射液(XST)组；采用插线法使大脑中动脉闭塞（MCAO）建立大鼠局灶性脑缺血模型，于造模24 h后进行行为学评分，测定脑组织含水量以及脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，脑梗死面积百分比，并进行组织病检查。结果 人参皂苷Rb3 40、80 mg/kg能明显缓解脑缺血大鼠的行为学症状，减轻其脑水肿程度，降低血清中MDA含量，升高SOD含量，并能减少其脑梗死面积，减轻组织病理学损伤。结论 人参皂苷Rb3对大鼠局灶性脑缺血损伤有较明显的保护作用。

【关键词】  脑缺血； 大脑中动脉闭塞（MCAO）；人参皂苷Rb3

 Protective effects of ginsenoside Rb3 on focal cerebral ischemic injury in rats

Abstract:Objective To study the protective effects of ginsengoside Rb3 on focal cerebral ischemia in rats.Methods 48 SD rats were divided randomly into sham?operated group, model group, ginsenoside Rb3 (20, 40 and 80 mg/kg) group and positive control drug (XST) group. The model of focal cerebral ischemia was made by middle cerebral artery occlusion (MCAO) with nylon suture; neuroethological scores were gotten 24 h after the development of the model. The water content of brain tissue, the activities of SOD and MDA in brain tissue and were measured, the percentage of cerebral infarction area to total brain area was calculated, and histopathological examination was conducted. Results  Ginsenoside Rb3 (at 40 mg/kg and 80 mg/kg) could significantly reduce the scores for neurological deficits and brain edema, improve the activities of SOD, lower the content of MDA, reduce the cerebral infraction area, and alleviate the cerebral ischemia injury. Conclusion Ginsenoside Rb3 had obvious protective effects on the focal cerebral ischemia in rats.

    Key words:brain ischemia;middle cerebral artery occlusion (MCAO);ginsenoside Rb3

     脑卒中是造成人类致死和致残三大原因之一，脑对缺血缺氧极为敏感，脑缺血会引起脑组织不同程度的损伤，严重者影响中枢神经系统的功能。目前对缺血性脑卒中神经元损伤的机理进行了深入的研究［1］，认为自由基的生成增加、中性粒细胞及巨嗜细胞的聚集、蛋白溶解酶的释放以及再灌注后血脑屏障的双相性开放是脑缺血再灌注损伤的发病机制。另外血脑屏障完整性在脑缺血后再灌注中发挥重要的病理生理作用：脑缺血再灌注后可使脑梗死及血脑屏障的破坏加重，且血脑屏障的破坏与脑血流的恢复存在相关性，局灶性脑缺血早期再灌注虽然有助于保护半暗区组织，但迟发性再灌注可加重脑损伤。脑梗死早期予以溶栓恢复缺血区脑血流可以减轻缺血性损伤，然而延迟再通可增加出血转化及脑水肿的危险［2］，这限制了溶栓的应用与推广。因此开发防治脑组织缺血性损伤的药物，延长血流再通的有效时间窗是有待解决的问题，也一直是相关学科研究的重点之一。

    　　人参皂苷是人参中的主要活性成分，到目前为止已确定了结构的皂苷单体至少在40 种以上。有关人参皂苷抗脑缺血损伤作用的报道虽然已有不少，但一般都是用人参总皂苷或人参二醇组皂苷，二者均是多种单体的混合成分，其作用的强弱和其所含单体的不同有关［3］。因此，对人参皂苷单体的研究显得极为重要。本实验着重研究了人参皂苷单体Rb3抗脑缺血损伤作用。

    1  材料与方法

    1.1  药品及试剂

    注射用人参皂苷Rb3 单体（50 mg/mL，由中山大学药学院提供）,血栓通注射液(由广东永康药业有限公司提供，生产批号：0709011),氯代三苯基四氮唑（红四氮唑或TTC）(Fluka公司产品),SOD和MDA检测试剂盒(南京建成生物工程公司产品)。

    1.2  实验动物分组及给药方法

    　　雄性清洁级SD大鼠（购自广东省医学实验动物中心,合格证号：2006A064），体质量230～280 g，随机分成：假手术组、模型对照组、人参皂苷Rb3低剂量组、人参皂苷Rb3中剂量组、人参皂苷Rb3高剂量组和血栓通注射液组，每组8只。于术前5 d每天1次分别给各组腹腔注射：人参皂苷Rb3低剂量20 mg/kg, 人参皂苷Rb3中剂量40 mg/kg, 人参皂苷Rb3高剂量80 mg/kg, 血栓通注射液0.45 mL/kg, 造模前0.5 h静脉注射给药1次；造模后4 h和10 h再分别进行腹腔注射给药。模型组和假手术组大鼠给予生理盐水，给药时间及体积同上。

    1.3  动物模型制备

   取0.235 mm尼龙渔线，截作每段8 cm左右，头端0. 5 mm加热成光滑的球形,距插入端10 mm、18 mm、20 mm三处分别用标记笔作标记，75%(φ)乙醇处理后置生理盐水中备用。

    1.3.2  手术方法

    　　将大鼠用10%(φ)水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，颈部正中切口,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，并分离翼额动脉（PPA）。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉近分叉处切口，插入拴线，插至稍感阻力时即可，其深度为17～20 mm，动脉外用手术线绑扎固定。栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。伤口和腹腔均注入少量抗生素后，缝合皮肤，回笼饲养。

    　　造模成功的标准：术后24 h，每只取手术侧脑小片进行TTC染色，变白色者为模型成功；动物手术后有明显手术侧（即左侧）Horner症（左侧眼睑下垂，眼球凹陷）及手术侧（即左侧）偏瘫体征（不能完全伸展左前肢，行走时向左侧倾倒或转圈）。

    1.4  行为学评分

    　　按照Longa ［4］ 神经功能缺损评分法进行评分,0 分: 无神经损伤症状;1 分: 不能完全伸展对侧前爪;2 分: 向对侧转圈;3 分: 向对侧倾倒;4 分: 不能自发行走, 意识丧失。神经功能缺损评分时间点同上。

    1.5  脑含水量测定

    　　神经病学评分后，快速断头取鼠大脑。取左侧半脑后半部分分别称湿重，置120 ℃烤箱烘干至恒重，按以下公式计算脑组织含水量，脑组织含水量(%)＝（湿重－干重）/湿重×100％。

    1.6  脑组织匀浆测定超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的含量

    　　脑组织匀浆液的制备:迅速断头取脑,取左侧半脑前小部分放于液氮中保存待测。从液氮中取出半脑称取100 mg,后置于9倍的生理盐水中,用研磨器于冰块上研磨,制成100%(Ｗ/Ｖ)脑匀浆液, 3 500 r/min,离心10 min。　　检测方法：MDA测定采用硫代巴比妥酸法, SOD活力检测采用黄嘌呤氧化法。

    1.7  脑梗死范围的测定

    　　造模后24 h大鼠，快速取全脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，冰冻25 min。然后行冠状切面取大脑中间一片，迅速置1％红四氮唑（TTC）中，避光，37 ℃温孵20 min，其间每隔7～8 min翻动一次，染色后以4％多聚甲醛固定。染色结果：正常组织呈红色，损伤梗死组织呈白色。拍照后以称重法计算脑梗死面积百分比。

    1.8  病理检查

    　　造模后24 h大鼠脑，于视交叉处行冠状切面取左侧脑中间一小片放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液保存超过48 ｈ。每个组织块均以乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片厚约4 μｍ，进行苏木素?伊红(Haematoxylin?Eosin，HE)染色。光镜下观察脑组织病理学变化。

    1.9  统计学处理

    各组数据以均数±标准差(±s)表示, 运用SPSS13.0统计软件进行资料t检验，P<0.05为差异有显著性。表1  对大鼠神经行为学评分的影响与假手术组比较：▲P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

    2  结 果

    2.1  行为学评分

    由表1可见，与模型组比较，人参皂苷Rb3 40、80 mg/kg组神经功能缺损评分明显降低，有明显统计学差异（P<0.05）。

    2.2  对脑缺血大鼠脑含水量的影响

    由表2可见，脑缺血24 h大鼠脑含水量明显升高，与假手术组比较差异有显著性（P<0.01）。与模型组比较，人参皂苷Rb340、80 mg/kg组脑含水量明显降低，差异有显著性（P<0.01）。

    2.3  脑组织中SOD和MDA含量

    表2  对脑缺血大鼠脑含水量的影响与假手术组比较：▲P<0.05;与模型组比较：**P<0.01表3  对脑缺血大鼠脑组织中SOD和MDA含量的影响与假手术组比较：▲P<0.05;与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01    由表3可见，与假手术组比较，模型组脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）含量明显升高，丙二醛含量明显降低，与模型组比较差异有显著性（P<0.01）。人参皂苷Rb3 40、80 mg/kg组脑组织中MDA含量明显低于模型组，差异有显著性（P<0.05）。人参皂苷Rb3各剂量组脑组织中SOD含量均高于模型组，差异有显著性（P<0.01）。

    2.4  对脑缺血大鼠脑梗死面积的影响表4  对脑缺血大鼠脑梗死面积的影响与假手术组比较：▲P<0.05;与模型组比较：*P<0.05由表4可见，人参皂苷Rb340、80 mg/kg组脑梗死面积均明显小于模型组，差异有显著性（P<0.05）。

    2.5  脑组织形态学变化

    　　大鼠经脑梗死术后24 h，病灶侧脑表面苍白、无光，脑表面血管较对侧充血，颜色变暗。镜下可见左半脑组织主要呈缺血性病理改变，经药物后充血脑组织缺血程度减轻。假手术组无明显缺血性病理改变。各实验组大脑组织病改变如下：

    　　假手术组：神经元的大小和形态结构基本正常，无明显水肿；神经细胞的胞浆丰富，核膜清楚，核仁清晰；神经胶质细胞核仁清晰，脑浆通亮或淡染，小血管、毛细血管周围间隙极小。

    　　模型对照组：脑组织病变区域，间质疏松，明显水肿；水肿区域的神经细胞、神经胶质细胞、小血管及毛细血管周围间隙明显变宽，多数细胞肿胀变形、着色加深；胞浆、胞核界线明显不清，部分胞核固缩明显，呈三角形，核膜结构模糊，核仁不清或消失。可见有脑组织毛细血管充血，有少量红细胞外漏至脑组织，可见炎症细胞浸润。

    　　人参皂苷治疗各组：比模型组病变有明显改善，脑组织神经细胞、神经胶质细胞、小血管及毛细血管周围间隙略变宽，皮层细胞变性程度明显减轻，部分细胞轻度或中度肿胀，胞核和胞浆有些不清，核仁比较模糊。以高、中剂量改善较明显。血栓通组也有明显的改善。

    3  讨 论

    　　关于局灶脑缺血动物模型已有很多报道［5］， 目前一致认为选用大鼠具有成本低、种系纯合性好, 与人类有类似的脑血管解剖特点等优点, 是最常选用的实验动物。此外, 大鼠抗感染能力较强, 生命力也强, 实验中动物感染较少, 存活时间相对较长。关于神经系统体征评分与梗死体积的相关性研究, 国外早有报道。Bederson认为神经系统体征评分与梗死体积有明显的相关性［6,7］。本研究结果也证实，神经学评分越高出现梗死灶就越明显。

    　　本研究选用SD大鼠复制MCAO大鼠模型，观察人参皂苷Rb3对缺血性脑中风的防治作用。实验结果表明，模型组偏瘫体征典型，脑水肿症状明显，脑梗死面积广泛，表明本实验模型建立成功。而人参皂苷Rb3中、高剂量可改善中动脉栓塞所致局灶性脑缺血大鼠的神经功能,明显缩小梗死面积、减轻脑水肿，显著降低中动脉栓塞大鼠大脑组织中的MDA 含量,增加SOD 含量。病理切片也表明人参皂苷Rb3可明显改善局灶性脑缺血时大鼠的脑代谢；维持脑缺血状态下神经细胞的正常形态和功能,延缓、减轻其坏死，表明人参皂苷Rb3 对大鼠脑缺血有较明显的保护作用。

    　　缺血性脑损伤的机制研究中［8，9］，兴奋性氨基酸假说、钙超载相关假说和自由基假说之间是相互联系的。脑缺血时，首先是三磷腺苷耗竭，膜去极化，L?型电压门控钙通道活化,Ca2＋内流,促使谷氨酸大量释放。后者结合突触后膜受体引起NR过度激活，导致胞内Ca2＋超载，激活包括磷脂酶在内的Ca2＋靶酶，膜磷脂水解，经代谢产生自由基，进一步使质膜和生物大分子破坏，导致缺血灶周边区神经元凋亡。脑缺血损伤时血小板活化因子合成显著增多，已证实在缺血的神经组织中血小板活化因子水平较正常高20倍，血小板活化因子通过使脑细胞内钙超载，参与一系列炎症反应，在缺血再灌注期产生自由基，使电解质平衡和能量代谢发生障碍，通过脂质过氧化致生物膜裂解导致神经细胞损伤，血脑屏障破坏，并可和其他细胞因子相互作用，加重脑细胞损伤。此外，血小板活化因子可使脑内兴奋性氨基酸增加，与突触后的N?甲基?D?天冬氨酸受体结合，引起Ca2＋超载，并可致Ca2＋内流，加重脑细胞水肿，加重脑损伤。血小板活化因子还可引起脑血管收缩，使脑血量减少；能损伤内皮细胞使血管通透性增加，血脑屏障通透性增高；能激活白细胞引起氧自由基及白三烯形成；有很强的促血小板聚集作用等，从而在脑缺血、继发神经元损伤中起重要作用。本实验重点研究了氧自由基的指标：SOD、MDA的含量。脑缺血后生成大量氧自由基(OR) 和脂质过氧化物(LP) 是造成神经元损伤的重要因素［10］。实验结果表明给药组可以明显降低MDA含量,即降低脑脂质过氧化速率；同时升高SOD的含量，加快对组织超氧阴离子自由基O-的清除。

    　　综上所述，人参皂苷Rb3能明显改善MCAO大鼠的神经功能缺损，缩小脑内梗死面积，缓解脑水肿；人参皂苷Rb3可以通过抗氧化损伤从而保护脑缺血损伤。本实验结果为人参皂苷Rb3的进一步研究与应用提供了有力的实验依据和理论支持。

【】
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