地塞米松磷酸钠温敏凝胶的制备
【摘要】 目的 设计和制备地塞米松磷酸钠（dexamethasone sodium phosphate,DSP）温度敏感原位凝胶，为其局部应用奠定基础。 方法 优选处方，考察各种附加剂对胶凝温度的影响，调节基质浓度以得到适宜的胶凝温度。采用差示扫描量热法（DSC）考察胶凝过程的热效应。 结果 确定以泊洛沙姆407为基质制备DSP温敏凝胶，得到优化处方：质量分数分别为14.1%的泊洛沙姆407，0.2%的透明质酸，10%的甘油，15%的丙二醇和2%的DSP。DSC测得其胶凝温度为26 ℃，而且胶凝过程热效应极低，焓变值为0.032 J·g-1·K-1。 结论 制备的DSP温敏凝胶在室温下为流体，在体温条件下可发生相变成为凝胶，值得进一步开发研究。
【关键词】 温度敏感原位凝胶；地塞米松磷酸钠；泊洛沙姆 407
Abstract:Objective To design and prepare dexamethasone sodium phosphate (DSP)?loaded thermosensitive in situ gel,and provide scientific information for clinical application.Methods Selection of different materials and their influence on gelation temperature (GT),were evaluated.Different GT could be obtained by adjusting the concentration of poloxamer 407.Heating curve of gelation process was investigated by employing differential scanning calorimetery (DSC).Results Poloxamer 407 was adopted as gel base to prepare DSP gel.The optimized formulation was composed of 14.1% poloxamer 407,0.2% hyaluronic acid,10% glycerin,15% propylene glycol and 2% DSP.GT of the formulation was 26 ℃ by DSC.And the DSC result displayed that delta Cp* was 0.032 J·g-1·K-1,which indicated packing of micelles and micelle entanglements may be possible mechanisms of poloxamer solution gelation with increased temperature.Conclusion The optimized formulation is free flowing liquid below room temperature and converted to a gel under the physiological condition,which has potential benefits of therapy.
Key words: thermosensitive in situ gel; dexamethasone sodium phosphate; poloxamer 407
原位系统是指可注射的液体以对人体极小损伤方式给药后，可在需要的组织、器官或体腔内发生相变立即固化或胶凝。其中，温度调节机制的原位凝胶在实际应用中比较有利：利用人体温度与环境温度的差异，既能注射给药，又可在生理温度下形成凝胶，并在所需的时间内保持完整，而不需要有机溶剂、聚合交联试剂以及其他外在因素触发胶凝［1,2］。因此，已在各种给药途径得到广泛应用，如可通过注射植入到皮下，形成埋植型药物控制释放系统；也可制成腔道给药的液体栓剂，使载药基质与多褶皱的粘膜组织紧密结合，为药物快速释放和更好地发挥疗效创造条件。类固醇激素已广泛用于多种疾病，目前应用以大剂量全身给药为主，而且用药时间长，这极大增加了药物的全身毒性，因而局部应用将是更安全有效的方式。本研究选用类固激素地塞米松磷酸钠（dexamethasone sodium phosphate,DSP）为模型药物，制备温度敏感原位凝胶，为其在临床上的局部使用奠定实践基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100 LC（美国）；NETZSCH DSC 204差示扫描量热仪（德国）；恒温磁力搅拌器85?2型（上海司乐仪器有限公司）；不锈钢手提式压力消毒器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
1.2 试药
DSP 原料（质量分数100.3％，天津天药药业股份有限公司赠送）；DSP对照品（药品生物制品检定所）；泊洛沙姆407 （Pluronic F127，P407，Sigma 公司）；透明质酸（MW ≥1.20 ×106，山东福瑞达生物化工有限公司赠送）；注射用甘油（汕头紫光古汉氨基酸有限公司）；甲醇为色谱纯，水为超纯水。其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 胶凝温度（gelation temperature，GT）的测定
参照［3］，西林瓶中盛有待测溶液和磁力搅拌子，插入温度计。将西林瓶放入冰水浴中，开启电磁搅拌，使水浴持续缓慢升温。磁力搅拌子完全停止转动的温度即为GT，平行测定3次，取平均值。
2.2 基质的筛选
曾以甘油明胶、淀粉甘油、明胶、果胶为基质，加热后虽可成粘度较低的溶液，但需冷却至体温以下才能成凝胶。而且，加热后注射，不仅使用不方便，也会对注射部位造成损伤。而P407具有受热反向胶凝的性质，即较低温度时为澄清溶液，可自由流动，但过了一定温度后粘度迅速增加，流动性迅速降低，很快转变成半固体透明凝胶；并且该凝胶可在固液两相间互变，当温度降低后又可转变成澄明溶液。因此，确定以泊洛沙姆407为基质。
2.3 处方设计
2.3.1 保湿剂和防腐剂
以水分损失率为评价指标，单因素考察各种保湿剂乳酸、山梨醇、甘油、1,2?丙二醇、聚乙二醇400和透明质酸的保湿效果。分别配制含上述10%（质量分数，以下同）保湿剂的16% P407，称重记为G1；置于37 ℃水浴7天，取出称重记为G2。水分损失率（（G1－G2）×100% / G1），结果见表1。由表可知，甘油保湿效果最好，因此选择甘油作为保湿剂。
表1 含不同保湿剂P407的水分损失率 （略）
Tab.1 Water loss of P407 including different ingredients (n=3)
1,2?丙二醇质量分数在 15% 以上有抑菌作用，而且还可作为稳定剂，抑制DSP 的水解［4］。因此，加入质量分数为15%的1,2?丙二醇作为防腐剂和稳定剂。
2.3.2 粘膜粘附性聚合物透明质酸浓度的确定
分别考察不同质量分数（0.1%，0.2%，0.3%）的透明质酸对P407溶液流动性和通针性的影响。结果表明，质量分数高于0.3%，溶液黏连。综合考虑制剂的粘附性和流动性，选定透明质酸质量分数为0.2%。
2.3.3 P407质量分数的选择
2.3.3.1 P407不同质量分数的胶凝温度 分别以水和PBS为介质，加入不同量的P407，搅拌使其分散均匀，置于4 ℃ 冰箱中保存至完全溶解从而得到不同质量分数的P407，测定其胶凝温度，结果见图1。
图1 分别以水或PBS为介质的不同质量分数P407胶凝温度（略）
Fig.1 The gelation temperature as a function of poloxamer 407 concentrations in pure water or PBS
结果表明，P407的胶凝温度具有浓度依赖性，可调节P407浓度以得到适宜的胶凝温度。而且，实验还发现，当P407溶液质量分数低于15％时，即使不断加温也只形成稠厚溶胶而不能完全胶凝。
2.3.3.2 处方中各组分对胶凝温度的影响 单因素考察处方中各组分对P407胶凝温度的影响。由于地塞米松人用剂量为每日几十毫克，因此凝胶中DSP 质量分数定为2%。以PBS为介质，分别加入甘油、丙二醇、HA、DSP，配制含10%甘油、15% 丙二醇、0.2%HA、2%DSP的同一质量分数（16%）P407溶液，分别测定胶凝温度，结果见表2。
表2 含不同附加剂的 P407 胶凝温度（略）
Tab.2 The gelation temperature of poloxamer 407 solution including different ingredient (n=3)
结果表明，加入甘油、丙二醇、透明质酸，可降低温度敏感凝胶的胶凝温度；而加入药物DSP能升高其胶凝温度。
2.3.3.3 P407浓度的确定 以 PBS 为介质，加入甘油、丙二醇、透明质酸和 DSP，分别加入不同量 P407，搅拌使其分散均匀，置于4 ℃冰箱中保存直至完全溶解，从而得到不同浓度的 P407，测定其胶凝温度，结果见图 2。
图2 不同质量分数P407的胶凝温度（略）
Fig.2 The gelation temperature as a function of poloxamer 407 concentrations
结果表明，P407质量分数低于 14.0%，不能完全胶凝。选择 P407质量分数为14.0% 和 14.1% 的处方在培养箱（37 ℃）中放置，分别于5 d，10 d后取出观察。结果发现，14.0% 的会软化，有些部分液化。因此，P407质量分数确定为14.1%。
2.4 DSP HPLC测定方法的建立
色谱条件：以甲醇-0.02 mol/L KH2PO4（磷酸调pH至4.0）（体积比55∶45）为流动相，色谱柱为Dikma Diamonsil－C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），检测波长240 nm，柱温 30 ℃，流速1 mL·min-1。在该条件下，空白凝胶对测定无干扰。
标准曲线方程： Y=1.121X+0.978，r=0.999 7 (n=5)，进样量在52.0～832.0 ng 范围内。日内与日间精密度分别为0.89%～1.72%和0.88%～1.89%,方法回收率为98.48%～101.82%。
2.5 工艺研究
按处方制备3批DSP温敏凝胶，采用热压灭菌（0.1 MPa，121 ℃，20 min）。各取灭菌前后凝胶适量，测定其胶凝温度；HPLC测定DSP含量，灭菌前后DSP含量比值，结果见表3。
表3 灭菌对DSP 温敏凝胶药物含量和胶凝温度的影响（略）
Tab.3 The results of DSP gel under sterilization
结果表明，在灭菌条件下制剂稳定性较好，DSP含量基本不变；胶凝温度略有升高（约0.5 ℃）。
最终确定DSP温敏凝胶制备工艺：将DSP加入到磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，搅拌溶解。加入粘附剂、保湿剂和防腐剂，搅拌使其分散溶解。然后加入P407，搅拌使其分散均匀，置4 ℃冰箱中保存，直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。将制得的溶液再经121 ℃热压灭菌20 min，即得。
2.6 胶凝过程热效应的测定
精密称取 DSP 温敏凝胶样品（No.1）11.196 mg 置于密闭的铝制坩锅中，以空坩锅做参比，测定 DSC 图谱（温度范围：10～40 ℃；升温速率：10 ℃/min；氮气保护：50 mL·min-1），结果见图 3。
图3 DSP温敏凝胶相变过程的DSC图谱（略）
Fig.3 DSC heating curve of phase transition
当胶凝由温度诱发时，从差示扫描量热法得到的加热过程中的吸热峰可以确定胶凝温度和焓变［5］。由图可见，DSP 温敏凝胶胶凝焓变值为 0.032 J·g-1·K-1，吸热峰的温度即胶凝温度为 26.58 ℃，与观察搅拌子转动方法测得结果一致。
3 讨论
3.1 关于温度敏感原位凝胶的设计
温度敏感原位凝胶药物传递系统融合了液体制剂和凝胶制剂的优点，溶胶-凝胶的相变特性使该系统适合注射给药或填充体腔。适宜的胶凝温度对于温敏凝胶的应用具有重要意义。调节温度敏感原位凝胶的胶凝温度需从使用方便和在体胶凝能力综合考虑。一方面，温敏凝胶在体外需为具有较好流动性的液体，胶凝温度必须低于体温。但若胶凝温度过低，需冷藏后才能使用，而且低温对组织也会产生刺激，由此造成顺应性不佳；另外从生产工艺角度考虑，过低的胶凝温度也会给凝胶的制备带来困难。另一方面，还要求温敏凝胶在体温作用下能立即胶凝，并在该温度下保持半固态。本研究筛选不同基质，应用各种辅料改善凝胶性质，按优化处方制得具有适宜胶凝温度的DSP温敏凝胶，在低于室温（26 ℃）条件下为流体，体温时形成凝胶，可满足局部注射给药和在体胶凝的要求，值得进一步研究。
3.2 关于胶凝温度的测定
采用观察搅拌子转动方法测定胶凝温度时，缓慢的升温速率、均匀的热传导和相对恒定的搅拌条件是保证测定结果准确、精密的重要因素，升温过快则测得的胶凝温度偏高，热传导不均匀和搅拌条件的改变会导致实验结果重现性较差。因此，所有样品胶凝温度的测定需在接近恒定的升温速率、相同的玻璃器壁厚度和保持搅拌子转速、形状及大小一致的条件下进行。DSC 分析为胶凝温度的测定提供了一种更加客观、精确的方法，结果表明该方法得到的胶凝温度与观察搅拌子转动方法测得结果一致。因此，在设计温敏凝胶的处方工艺时，可采用更简便的肉眼观察方法来判定胶凝温度。
3.3 关于P407 和附加剂的选用
泊洛沙姆具有良好的耐受性，一般认为无毒，能被肾和胆汁排泄。其水溶液具有受热反向胶凝的性质，其中P407 的胶凝温度比泊洛沙姆系列的其他都低，在当前上市的药品中已作为辅料使用，因此选用 P407 为凝胶基质。凝胶进入体内后，所处环境温度在 37℃左右，为保持凝胶形态防止变干，需加入保湿剂，经筛选选用甘油。由于制剂处方参照注射剂设计，因而限制了防腐剂种类的选择，而 1,2?丙二醇不仅有抑菌作用，还能起到稳定 DSP 的作用。温敏凝胶中常需加入粘膜粘附性聚合物以增强制剂的粘附能力使其在体内的滞留时间延长，提高药物的局部生物利用度。本实验所选用的透明质酸具有粘膜粘附性，可增强制剂的粘附能力，而且还具有一定的保湿功能。
3.4 关于胶凝温度的影响因素
泊洛沙姆胶凝机理常被认为是随着温度升高胶束间相互缠结和堆砌的结果［1,2,6］。P407的胶凝温度随P407浓度增大而降低。这可能是因为浓度越高，聚合物所占溶液的体积分数就越大，胶束数量及相互间接触和缠结的几率均增大，因而胶凝温度呈现浓度依赖性。
以PBS为介质的胶凝温度随P407浓度的增大，但较介质为水时约低3.5℃（图1），说明PBS会降低 P407 溶液的胶凝温度。可能是因为PBS所含的多种离子（Na+，Cl-，PO3-4等）的盐析作用，诱发PEO嵌段脱水，使胶束堆砌更加紧密，降低了临界胶束浓度和临界胶束温度［7］。
加入甘油、丙二醇、透明质酸，可降低温敏凝胶的胶凝温度。这可能是因为加入的甘油和丙二醇挤占了水的体积，而透明质酸用量虽少，但其分子量很大，完全水化膨胀后占据一定的溶液体积分数，这些都使泊洛沙姆浓度相对增加，导致其胶凝温度降低。三者混合后胶凝温度的降低值并不是各种组分的机械相加，可能是因为三者能够互相溶解，部分消除了每种组分对胶凝温度的影响。加入药物能升高胶凝温度，推测是DSP与泊洛沙姆的PEO?PPO?PEO发生相互作用，阻碍了链间的交联。以上机理还需进一步研究。
3.5 关于胶凝过程的热效应
采用 DSC 分析可以测定胶凝温度和焓变［5］。有人认为高度规则结构的形成，例如立方水晶，是泊洛沙姆水溶液形成凝胶的动力［5,8］。但在泊洛沙姆溶液胶凝过程中仅能够观察到极微弱的热效应。由于生成高度有序的结构常伴随着明显的能量变化，因此可逆物理交联如胶束的互相包裹和纠缠，可能是温度升高时泊洛沙姆胶凝的主要机制［6］。
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