芦荟大黄素苷与DNA相互作用的研究

                     作者：韦欣煜,梅文杰,刘云军  

【摘要】  目的 探讨芦荟大黄素苷与DNA的相互作用。方法 采用吸收光谱，荧光发射光谱，粘度实验以及凝胶电泳实验进行研究。结果与结论 芦荟大黄素以插入方式与DNA分子结合；较高浓度的芦荟大黄素苷能够使Bel?7402肝癌细胞DNA由超螺旋构型转化为缺刻构型。

【关键词】  芦荟大黄素苷；分子识别；凝胶电泳；DNA

　　Abstract:The binding properties of barbaloin to DNA were investigated by UV?visible electron absorption spectrum,fluorescence emission spectrum,viscosity measurement and gel electrophoresis,and insertion of barbaloin to DNA was identified.Higher concentration of barbaloin could convert DNA configuration of hepatoma carcinoma cell Bel?7402 from superhelix to indention.

　　Keywords:barbaloin; molecular recognition; DNA

　　芦荟是一种传统的常用中药，用于如烧伤、烫伤等疾病并被广泛应用于食品和化妆品等行业，并被。芦荟大黄素苷(图1)是芦荟块茎的主要成分,异芦荟大黄素苷是植物中的主要存在形式，通过非酶催化转化为芦荟大黄素苷，因此通常得到的是芦荟大黄素苷和异芦荟大黄素苷的混合物［1，2］。芦荟的抗菌、抗炎、抗氧化作用等与芦荟大黄素苷的存在密切相关［3，4］。在生物体内芦荟大黄素苷通过代谢转化为芦荟大黄素而发挥药理作用［5，6］。

　　图1  芦荟大黄素苷和异芦荟大黄素苷的分子结构（略）

　　Fig.1  The molecular structure of barbaloin and isobarbaloin
   
　　近年来的研究表明，芦荟大黄素具有抑制肿瘤细胞生长的作用［7-12］。研究发现芦荟大黄素能促进人早幼粒HL?60白血病细胞P27基因过度表达，并诱导肿瘤细胞凋亡［13］。一般认为DNA是抗肿瘤药物的靶点之一［14］。药物分子可以通过共价结合、插入作用、沟结合方式或静电结合方式与DNA分子缔合，对DNA的构象产生微扰，达到抑制肿瘤生长的目的。
    
　　本文采用荧光光谱和流体力学方法研究了芦荟大黄素苷与DNA分子的缔合机理。结果表明芦荟大黄素苷能够以插入方式与DNA分子结合；凝胶电泳实验结果表明，光照下芦荟大黄素苷能够使Bel?7402肝癌细胞DNA的超螺旋构型发生一定程度的转化。

　　1  实验部分

　　1.1  仪器与试剂
    
　　芦荟大黄素苷由中山大学化学与化学工程学院陆伟刚博士提供;Bel?7402肝癌细胞由中山大学肿瘤研究所提供。所用化学试剂均为分析纯，除非另有说明，所有试剂未作任何处理。芦荟大黄素苷用5 mmol/L Tris?HCl,50 mmol/L NaCl(pH=7.2)缓冲溶液配制。小牛胸腺DNA（华美公司）；电泳级琼脂糖（Promega公司）。MPS?2000型紫外可见光谱计（Shimadzu）；RF?2000型荧光分光光度计（Shimadzu）；乌氏粘度计；DYY?Ⅲ?4型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  Bel?7402肝癌细胞的提取
    
　　按方法［15］进行：收集培养好的Bel?7402肿瘤细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤,14 000 r/min离心5 min，收集底部白色固体沉淀，重复3次,加入RNase A（20 mg/mL）50 μL和 质量分数为10%的SDS 20 μL，56 ℃孵育2 h,然后加入蛋白酶K（20 mg/mL）35 μL，37 ℃孵育24 h,加入10 mol/L NH4OAc 150 μL和无水乙醇1.2 mL，20 ℃过夜，得到DNA的溶液，离心、干燥后，将DNA溶解在150 μL Tris?HCl缓冲溶液中。

　　1.2.2  紫外-可见吸收光谱实验
    
　　在参比池和样品池中分别加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，当芦荟大黄素苷的电子吸收光谱不再变化，此时吸收滴定达到饱和。

　　1.2.3  荧光光谱实验
     　　
　　在样品池中加入一定体积的芦荟大黄素苷溶液，每次往池中加入一定体积的DNA，直至荧光光谱不再变化。

　　1.2.4  粘度实验
    
　　在(25±0.1) ℃恒温水浴中使用乌氏粘度计测量。DNA的流出时间用数字秒表测量得到，每个样品测量3次，取3次测量的平均值，以(η/η0)1/3芦荟大黄素苷的浓度作图［16］。
    
　　η = t -t 0
    
　　η:DNA的粘度；t:DNA溶液的流出时间；t0:缓冲溶液的流出时间；η0:没有加入芦荟大黄素苷时DNA的粘度。

　　1.2.5  电泳实验
    
　　TBE缓冲溶液中、1％的琼脂糖凝胶上进行，电泳电压30 V，电泳40 min，溴乙锭染色，照相。

　　2  结果与讨论

　　2.1  DNA对芦荟大黄素苷电子吸收光谱的影响
    
　　电子吸收光谱是研究小分子化合物与生物大分子相互作用的常用方法之一。室温下Tris?HCl(pH=7.2)缓冲溶液中，芦荟大黄素苷在300～400 nm之间有一个强的π?π*跃迁，其电子吸收峰的最大值为359 nm。当向溶液中加入小牛胸腺DNA以后，芦荟大黄素苷的电子吸收光谱出现明显减色效应，其电子吸收降低约5％(Δλ＝1 nm)，见图2。

　　图2  芦荟大黄素苷与DNA作用的紫外可见光谱变化图（略）

　　Fig.2  The electronic spectra of barbaloin in the absence and in presence of CT?DNA

　　2.2  DNA对芦荟大黄素苷荧光发射光谱的影响
    
　　室温下，Tris?HCl缓冲溶液中，当用260 nm波长激发，芦荟大黄素苷在360～440 nm之间有一个荧光发射峰，其荧光发射峰的最大位置在372 nm。当向溶液中加入小牛胸腺DNA后，芦荟大黄素苷的荧光发射峰明显增强，见图3。这可能是芦荟大黄素与DNA分子结合后，由于DNA双螺旋链具有疏水性作用，能够保护芦荟大黄素分子不受水分子的淬灭作用。

　　图3  芦荟大黄素苷与DNA作用的荧光发射光谱变化图（略）

　　Fig.3  The emission spectra of barbaloin in absence and in presence of CT?DNA

　　2.3  芦荟大黄素苷对DNA粘度的影响
    
　　当小分子化合物与DNA分子作用后，由于其作用模式的不同，对DNA的粘度将产生不同的影响。一般来说，当化合物以插入方式与DNA分子作用后，由于化合物分子嵌入到DNA的碱基对中，使DNA双螺旋链拉张，将导致DNA的粘度上升；而以沟面结合方式与DNA作用的化合物，由于使DNA双螺旋链发生不同程度的折叠和扭曲，将使其粘度下降；以静电作用方式与DNA分子结合的化合物，对其粘度的影响则出现无的变化。芦荟大黄素苷对小牛胸腺DNA的粘度的影响见图4。从图中可以看到，当DNA溶液中加入芦荟大黄素苷后，DNA的粘度明显增强，表明芦荟大黄素苷是以插入方式与DNA分子结合。

　　图4  DNA溶液粘度变化图（略）

　　Fig.4  The viscosity of CT?DNA in presence of barbaloin.EB(▲)；barbaloin (■)

　　2.4  芦荟大黄素苷对Bel?7402肝癌细胞DNA的光裂解作用
    
　　一般来说，不同构型DNA在电场中迁移速率不同。具有超螺旋结构的DNA分子由于结构紧密，在电场中迁移速率最快，而缺刻构型的DNA破坏了DNA的双螺旋结构，在电场中的迁移速率最慢，线性构型DNA分子在电场中迁移的速率居于两者之间。芦荟大黄素苷对Bel?7402肝癌细胞DNA的影响见图5。从图中可见，当体系中未加入芦荟大黄素苷时(Lane 1),Bel?7402肝癌细胞DNA主要是以超螺旋构型存在(Form I)；当向体系中加入低浓度的芦荟大黄素(Lane 2-4),Bel?7402肝癌细胞DNA构型无明显变化；但是在高浓度芦荟大黄素作用下(Lane 5),Bel?7402肝癌细胞DNA构型发生变化，其缺刻构型（FormⅡ）的比例明显增加，表明芦荟大黄素以插入方式嵌入到Bel?7402肝癌细胞DNA中。

　　1. DNA  2.DNA+芦荟大黄素(25 μmol/L)  3.DNA+芦荟大黄素(50 μmol/L)  4. DNA+芦荟大黄素(75 μmol/L)  5.DNA+芦荟大黄素(100 μmol/L)

　　图5  磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中芦荟大黄素对Bel?7402旰癌细胞DNA的光裂解作用（略）
　　
　　Fig.5  Electrophorogram of liver cancer cells Bel?7402 DNA in absence and in presence of barbaloin in phosphate buffer (pH 7.4) solutions

　　3  结论
    
　　以上研究表明，芦荟大黄素能够以插入方式与Bel?7402肝癌细胞DNA分子发生契合。契合以后，芦荟大黄素分子对Bel?7402肝癌细胞DNA分子的结构会产生微扰，并使其由超螺旋构型向缺刻构型转化，这可能是芦荟大黄素具有抗肿瘤作用的一个原因。

【】
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