不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
作者：庞金辉，黄煌渊，张权，纪斌，曹成福
【摘要】 目的 观察不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨分化、增殖能力及凋亡率的影响。方法 以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞进行体外培养，以1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L 4种不同浓度地塞米松分别处理细胞。检测各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性；RT?PCR法检测骨桥蛋白(OPN)基因的表达；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定各组细胞的增殖率；流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 低浓度(1×10-9mol/L)地塞米松对ALP的表达无显著作用(P>0.05)，而1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显增加ALP的活性(P<0.01)；所有实验组的hMSCs均有OPN mRNA表达，其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强；1×10-9mol/L地塞米松对细胞增殖无明显影响(P>0.05)，1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖(P<0.01)；体外培养的hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高 (P<0.01)。结论 1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可显著增强hMSCs成骨分化能力，同时抑制细胞增殖并促进其凋亡。
【关键词】 间充质干细胞；地塞米松；碱性磷酸酶；骨桥蛋白；细胞增殖；凋亡
Abstract： Objective To observe the effect of dexamethasone on the biological characteristics of human mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from bone marrow in vitro.Methods The primary hMSCs were isolated and cultured in vitro．In subcultures，hMSCs were respectively treated with four different concentrations of dexamethasone(1×10-9,1×10-8,1×10-7 and 1×10-6mo1/L)．The alkaline phosphatase(ALP) activity was measured；mRNA of osteopontin was observed by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT?PCR);the proliferation of hMSCs was evaluated by MTT assay；apoptosis was examined with flow cytometer.Results Treatment of cells with high concentration of dexamethasone(1×10-8,1×10-7 and 1×10-6mo1/L) for 8 days led to a significant increase in ALP activity(P<0.01)．The osteopontin mRNA was induced by different concentration of dexamethasone respectively．The optical density value of hMSCs treated with high concentration of dexamethasone for 6 days was significantly lower than that of the controls(P<0.01)．Dexamethasone increased the apoptosis rate of all hMSCs cultured in vitro．Conclusion The high concentration of dexamethasone(1×10-8,1×10-7 and 1×10-6mol/L) induces the differentiation of hMSCs to osteoblastic cells,inhibits the proliferation of cells and leads to an increase of its apoptosis rate．
Key words：mesenchymal stem cells；dexamethasone；alkaline phosphatase；osteopontin；cell proliferation；apoptosis
骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是近年来骨组织工程和干细胞研究的热点种子细胞之一。目前已知，地塞米松可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，但是地塞米松对骨髓间充质干细胞影响的系统性研究较为鲜见。本文探讨不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞成骨分化、增殖能力及凋亡率等方面的作用，旨在更深入地了解地塞米松对hMSCs生物学特性的影响。
材料与方法
1 主要试剂
DMEM培养基（Hyclone公司）、地塞米松（Sigma公司）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）定量检测试剂盒（Sigma公司）、Annexin V凋亡检测试剂盒（Bender公司）、TRIzol（Sigma公司）。
2 人hMSCs的体外培养与观察
骨髓标本均取自无血液疾病或骨病的成年人，事先征得所有献髓者的同意。将抽取的红骨髓以磷酸缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）稀释制成悬液，小心叠加至淋巴细胞分离液之上，离心，收集呈云雾状的有核细胞层，接种于10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2及饱和湿度条件下孵育定期换液，待细胞生长至90%融合时，消化传代。随机抽取生长良好的细胞分5组：1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L地塞米松组和不含地塞米松的对照组，实验组分别称为1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L组。利用倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。
3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定hMSCs的增殖率
取hMSCs以2000/孔接种于96孔板培养，随机分组后加入指定浓度的地塞米松，对照组则不加地塞米松。6天后加无血清DMEM培养液100μl，MTT 10μl，置37℃孵育4小时，加入十二烷基磺酸钠（SDS）100μl，37℃放置2小时，经酶标仪测定吸光度OD。依次测定各实验组和对照组细胞的相对增殖率ODMTT，每组测定14孔。
4 ALP活性的测定
hMSCs以2000/孔接种于96孔板培养，实验组加入不同浓度的地塞米松。培养8天后加入100μl二已胺醇，50μl 3mmol/L PNPP，37℃孵育30分钟，加入50μl 0.2 mmol/L NaOH终止反应，经酶标仪405nm波长测ODALP值。每组样本量为14孔，分别除以对应的ODMTT均数，得出ALP相对活性比值。
5 hMSCs凋亡率的检测
将hMSCs以5×103/cm2的密度接种于培养皿，分组用地塞米松处理，每组6皿细胞。地塞米松干预8天后，采用Annexin V/PI双染色法对hMSCs进行凋亡率检测。取沉淀细胞490μl，先后加入Annexin V和PI工作液，暗处冰浴10分钟上机检测。每组样本量为6个，每个样本至少检测10000个细胞。
6 逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）法检测细胞骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因表达
6.1 逆转录（RT）反应 取hMSCs，分组用不同浓度的地塞米松干预12天，TRIzol法抽提细胞总RNA，反转录反应合成cDNA。将配制好的反应混合物加灭菌纯水至20μl，37℃水浴60分钟，进行反转录反应；97℃水浴5分钟，然后迅速置于冰上。
6.2 聚合酶链反应（PCR）扩增 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。OPN引物的上游序列为：5'?CTAGGCATCACCTGTGCCATACC?3'，下游序列：5'?CTACTTAGACTACTTGACCAGTGAC?3'，扩增片段长度为330bp。以β?actin作为内参照，上游序列为：5'?TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA?3'，下游序列：5'?CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG?3' ，扩增片段长度为660bp。PCR条件设置如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，57℃退火60秒，72℃延伸90秒，共循环28次，最后72℃延伸10分钟，终止反应。
6.3 RT?PCR产物电泳 取PCR产物5μl，置于1.5%琼脂糖上，80V电压下电泳1小时，观察并拍照。
7 统计学分析
采用完全随机方差分析，均数间比较采用LSD法。处理软件：SPSS v11.00。
结 果
1 hMSCs的形态学观察
原代接种24小时后即可观察到部分细胞贴壁，大多呈圆形或椭圆形；48～72小时后大多数细胞贴壁，呈现梭形、纺锤形。传代培养时hMSCs贴壁速度快，绝大部分可在24小时之内贴壁，为成纤维细胞状，伴有突起，核较大，呈椭圆形，核仁清晰(图1)。在早期培养，以5×103/cm2接种的hMSCs培养5天可达90%汇合。
hMSCs经地塞米松诱导后，形态上由长梭形逐渐转变为立方型、多角型，胞浆色深，含粗大颗粒，胞核明显(图2)。观察发现，10-8mol/L及以上浓度地塞米松处理的hMSCs增殖速度比对照组慢。
2 不同浓度地塞米松对hMSCs增殖的影响
MTT法显示，10-9mol/L地塞米松组ODMTT与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。10-8、10-7和10-6mol/L组的ODMTT值分别为0.994±0.073、0.725±0.085和0.503±0.056，与对照组相比均有显著下降，降幅分别达30.1%、49.0%和64.6%，说明这些浓度的地塞米松可明显抑制体外培养hMSCs的增殖(P<0.01)。如图3所示。
3 地塞米松对hMSCs ALP活性的影响
hMSCs用不同浓度地塞米松分别处理8天，然后检测各组细胞的ALP活性，结果如图4所示。与对照组相比，低浓度(10-9mol/L)地塞米松对ALP表达的影响无统计学意义(P>0.05)，而10-8mol/L及以上的浓度地塞米松可明显增强ALP的活性(P<0.01)，均数的增幅分别达131.6%(10-8mol/L组)、228.2%(10-7mol/L组)和248.1%(10-6mol/L组)。组间分析显示，10-8mol/L组与2个更高浓度组（10-7、10-6mol/L组）相比均有显著差异(P<0.05)，而10-7mol/L组和10-6mol/L组之间无统计学差异(P>0.05)。
4 地塞米松作用下hMSCs凋亡情况的检测
凋亡检测结果显示（如图5），体外常规培养8天的hMSCs凋亡率（%）为3.68±0.21，实验组的凋亡率（%）分别为5.71±0.10（10-9mol/L组）、7.7±0.09（10-8mol/L组）、8.33±0.21（10-7mol/L组）和12.24±0.19（10-6mol/L组）。由此可见，体外培养的hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高。与对照组相比，各种浓度地塞米松实验组凋亡率的增加均有高度统计学意义(P<0.01)。
5 地塞米松对hMSCs OPN基因表达的影响
hMSCs经10-9、10-8、10-7、10-6mol/L地塞米松作用12天后，均有OPN mRNA表达，其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强，对照组则无相应的条带出现（图6）。
讨 论
hMSCs是一种源自骨髓基质的干细胞，具有多向分化潜能，经不同条件诱导，可以分化为包括骨、软骨、脂肪和神经等多种组织细胞。hMSCs经地塞米松诱导后可以分化为成骨系细胞，外形呈立方形，细胞器丰富，合成并分泌特异性ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素和OPN等［1］。笔者的前期研究亦证实，MSCs经10-8mol/L地塞米松诱导后，细胞形态由成纤维细胞状转化为立方形或多角形，ALP染色、Ⅰ型胶原和骨钙素的免疫组化染色及钙化结节Von Kossa染色呈阳性，具备了成骨细胞的特性［2］。本文在此基础之上，深入研究10-9、10-8、10-7和10-6mol/L 4种不同浓度地塞米松对MSCs成骨能力、增殖能力和凋亡率的影响。
本研究选取ALP活性和OPN mRNA的表达分别作为评价细胞成骨能力的早、晚期指标。ALP是成骨细胞及其分化的早期标志性酶，能水解有机磷酸盐释放出无机磷，并启动钙化进程。ALP的活性在一定程度上反映了细胞的成骨能力。本研究数据显示，高浓度（≥10-8mol/L）地塞米松可显著增强hMSCs的ALP活性，且活性随着地塞米松浓度的升高而增强，可达到对照组的2～ 3.5倍，但10-7与10-6mol/L浓度组之间无显著差异，提示10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可促进hMSCs成骨分化，但过高的浓度（10-6mol/L）并不能提供更强的成骨诱导功效，即存在“天花板效应”。OPN是由成骨细胞分泌的一种高度磷酸化的糖蛋白，在类骨质的矿化过程起重要作用［3，4］。在成骨细胞分化晚期(基质矿化期)，OPN与骨钙素等一起分泌至细胞外基质中，与钙、磷及胶原分子结合，形成羟基磷灰石结晶。本研究的RT?PCR结果显示,不同浓度的地塞米松组均有OPN mRNA表达，其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强。本研究结果证实地塞米松可促进体外hMSCs的成骨分化［5-7］，并提示地塞米松对hMSCs的成骨诱导能力上，10-7、10-6mol/L浓度较10-8mol/L更强。
有研究表明，地塞米松在促进hMSCs成骨分化的同时，抑制细胞的增殖［1，8］。本研究进一步发现，在10-9至10-6mol/L的浓度范围内，地塞米松对hMSCs增殖的抑制作用呈剂量相关性，地塞米松浓度越高抑制作用越明显。但Walsh等［9］的实验表明10-8mol/L地塞米松对MSCs增殖影响存在不确定因素，促进、抑制或无影响都有可能。本文的凋亡检测结果显示，4种浓度的地塞米松均可增加体外培养hMSCs的凋亡率，且凋亡率随地塞米松浓度的升高而增高。Oshina等［10］研究亦证实地塞米松能有选择性地促进分化能力差的hMSCs凋亡。
在以MSCs为种子细胞的骨组织工程中，应处理好地塞米松促进成骨分化与抑制增殖和增加凋亡之间的关系。地塞米松的工作浓度以10-8mol/L为佳，此浓度可显著增强MSCs的ALP活性，同时对细胞增殖的抑制作用较小，凋亡率也不高，可以获得代谢活跃、分化功能良好的有活力的种子细胞。
此外我们认为，高浓度的地塞米松虽能促进MSCs的成骨分化，但明显地抑制细胞增殖，并导致细胞凋亡的增加，从而使得具有成骨分化能力的有效骨祖细胞数量大量减少，最终对成骨作用在总体水平上起负面效应。另有研究表明，地塞米松可以促进MSCs成脂分化［11，12］。这两方面因素协同作用，使得成骨与破骨作用之间的动态平衡遭到破坏，处于负平衡状态，骨量不断丢失，最终导致骨质疏松。这可能是临床上大量应用糖皮质激素导致骨质疏松和（或）股骨头无菌性坏死的发病机制之一［13-15 ］。
【】
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