谷氨酰胺对入肝血流阻断后肠道损伤的影响及机制探讨

                       作者：刘国平，朱闻溪，周文平，程广明 

【摘要】  目的 探讨谷氨酰胺（Gln）对入肝血流阻断后肠道损伤的影响及其机制。方法 将雄性Wistar大鼠120只，随机分为3组：假手术组（1组）、对照组（2组）和实验组（3组）。每组40只。2组和3组采用Pringle's法进行入肝血流阻断，持续35分钟，在阻断前3组大鼠腹腔注射Gln（300mg/kg，用生理盐水稀释至4ml），每天2次，连续5天。每组随机抽取10只大鼠分别于阻断前及再灌注后2、4、24小时，测定肠组织丙二醛（MDA）含量，检测血清肿瘤坏死因子?α（TNF?α）及门静脉内毒素水平。光镜观察并测定肠黏膜厚度、肠绒毛高度。采用逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）法检测再灌注后24小时肠道高迁移率族蛋白B1（HMGB1）mRNA的表达。结果 与1组相比，再灌注后2、3组MDA含量、TNF?α及内毒素水平增高（P<0.05），而肠黏膜厚度、肠绒毛高度下降（P<0.05）。与2组相比，再灌注后3组MDA含量、TNF?α及内毒素水平降低（P<0.05），而肠黏膜厚度、肠绒毛高度明显增加（P<0.05）。再灌注后24小时，与2组相比，1、3组HMGB1mRNA表达水平均明显降低（P<0.05）。结论 Gln能够抑制入肝血流阻断后内毒素移位、炎性因子释放及肠道HMGB1mRNA的表达，具有减轻肠道损伤的作用。

【关键词】  肠道损伤；谷氨酰胺；血流阻断；高迁移率族蛋白B1

    Abstract：  Objective  To discuss the effect of L?glutamine(Gln) on intestinal injury following total hepatic inflow occlusion and its related mechanism.Methods  Male Wistar rats were assigned randomly to three groups(n=40):group 1 served as sham?operation group;group 2 served as control,rats were pretreated with 4ml 0.9% saline intraperitonally twice per day for 5 days consecutively.In group 3,rats were pretreated with 300mg/kg Gln dissolved in 4ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day for 5 days consecutively.The rats from group 2 and 3 underwent total hepatic inflow occlusion for 35minutes through Pringle’s methods.Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion and at 2,4,24hours after reperfusion respectively.The levels of malondialdehyde(MDA) in intestine tissue,serum TNF?α and portal?vein endotoxin were measured.Villus height and mucosal thickness were measured under light microscope.The expression levels of HMGB1mRNA in intestine at 24hours after reperfusion were measured by reverse transcription polymerase chain reaction.Results  Compared with group 1,the levels of MDA,TNF?α and endotoxin in group 2 and 3 increased(P<0.05),while mucosal thickness and villus height decreased significantly after reperfusion(P<0.05).Compared with group 2,the levels of MDA,TNF?α and endotoxin in group 3 decreased(P<0.05),while mucosal thickness and villus height increased after reperfusion(P<0.05).Compared with group 2,the levels of HMGB1mRNA expression in group 1 and 3 decreased(P<0.05) at 24hours after reperfusion.Conclusion  Gln could alleviate the  injury of gut after Pringle’s methods,which might be related with the role of Gln in inhibiting the expression of HMGB1mRNA,the translocation of gut?derived endotoxin and release of proinflammatory factors.

    Key words:intestial injury;L?glutamine;blood occlusion;HMGB1

     入肝血流阻断不但引起肝脏缺血再灌注损伤，还可造成门脉系统的回流障碍引起肠道损伤；不仅如此，后者会进一步引起肠源性内毒素血症，细菌移位及炎性递质的连锁反应，从而加重肝脏损害［1］。因此设法维护肠道屏障的完整性，对于减轻入肝血流阻断后肝脏损害具有重要意义。众所周知，谷氨酰胺（Gln）具有维持肠黏膜新陈代谢、结构和功能的作用，但对于入肝血流阻断后肠道屏障的影响尚缺乏系统研究。为此，本研究将采用动物模型，深入探讨Gln对入肝血流阻断后肠道屏障的影响及相关机制，为临床应用提供实验依据。

     材料与方法

    1  实验动物分组及处理

    雄性Wistar大鼠120只，体重300～350g,随机分为3组（n=40）：（1）假手术组（1组）；（2）对照组（2组）：生理盐水4ml，腹腔注射，每天2次，连续5天；（3）实验组（3组）：Gln溶液（300mg/kg，用生理盐水稀释至4ml），腹腔注射，每天2次，连续5天。术前禁食12小时，自由饮水。所有动物均采用戊巴比妥钠（3.5mg/100g）腹腔内注射进行麻醉，首先每组随机选取10只大鼠，开腹后用无菌、无致热源的注射器取门静脉血1ml,置于无菌、无致热源装有0.2ml肝素盐水（12IU/ml）的EP管内，3000g离心40秒，分离出血浆置于无热源EP管内，-30℃保存待测。自心脏取血5ml,静置20分钟，4000g离心10分钟，分离血清，-30℃保存待测。距Treitz韧带以远约15cm处向近端切取约10cm空肠段，用0℃生理盐水冲洗干净，将近心端5cm肠组织置于－70℃中保存待测,其余放入10％甲醛溶液中固定。余下的大鼠除1组仅行麻醉和开腹术外，均沿腹正中切口切开腹腔，显露第一肝门，采用Pringle's法用无创血管夹阻断肝十二指肠韧带，持续35分钟后，撤夹恢复血流。分别于再灌注后2、4、24小时每组各选取10只大鼠处死，收集血浆，分离血清，置于-30℃冰箱中保存，并按前面所述的方法采集肠标本保存待测。

    2  主要试剂

    L?Gln(上海康达氨基酸厂)；内毒素检验试剂盒（广东湛江海洋生物制品所）；TNF?α夹心法ELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；丙二醛（MDA）试剂盒(南京建成生物研究所)，试剂配置及试剂序号按照试剂盒说明书所述；大鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB1）引物(TaKaRa公司)，序列为：HMGB1扩增产物长度为680bp，上游5'?ATGGGCAAAGGAGATCCTA?3',下游5'?ATTCATCATCATCATCTTCT?3'；内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由TaKaRa公司合成，序列为：GAPDH扩增产物长度为528bp，上游5'?ACCACCATGGAGAAGGCCGG?3',下游5'?CTCAGTGTAGCCCAGGATGC?3'；反转录试剂盒及PCR扩增所需的试剂购自TaKaRa公司。

    3  检测方法

    血清TNF?α含量采用ELISA方法测定。内毒素采用反应时间法测定。肠道组织中MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。肠组织形态学：取甲醛固定的肠标本，酒精脱水，石蜡包埋，常规切片，苏木精?伊红（HE）染色，光镜观察组织形态学变化，并采用HPIAS?1000病理图文分析系统测定肠黏膜厚度，肠绒毛高度。再灌注后24小时每组各选取5只大鼠肠道标本，采用RT?PCR的方法检测HMGB1  mRNA的表达。

    4  统计学处理

    数据结果均以均值±标准差表示，统计学差异性检验采用SPSS11.5统计软件进行完全随机设计方差分析，样本之间采用LSD法进行两两比较。

     结  果

    1  各组大鼠肠组织MDA水平的变化

    再灌注后各时相点3组肠道MDA水平均明显低于2组（P<0.05）；与1组相比2、3组MDA水平明显增高（P<0.05）。术前各组间无差异（见表1）。

    2  各组大鼠血清TNF?α水平的变化

    再灌注后各时相点，3组血清TNF?α水平明显低于2组（P<0.05）；2组、3组则明显高于1组（P<0.05）；术前各组间无统计学差异（见表2）。

    3  各组大鼠门静脉血浆内毒素水平的变化

    再灌注后各时相点，3组门静脉血浆内毒素水平明显低于2组（P<0.05）；2组、3组则明显高于1组（P<0.05）；术前各组间无统计学差异（见表3）。

    4  各组大鼠肠绒毛高度的变化

    再灌注后各时相点，3组肠绒毛高度明显高于2组（P<0.05）；2组、3组则明显低于1组（P<0.05）；术前各组间无统计学差异（见表4）。

    5  各组大鼠肠黏膜厚度的变化

    再灌注后各时点，3组肠黏膜厚度明显高于2组（P<0.05）；2组、3组则明显低于1组（P<0.05）；术前各组间无统计学差异（见表5）。

    6  再灌注后24小时肠道HMGB1mRNA表达的变化

    1、2、3组HMGB1mRNA的表达相对量分别为：1.012±0.015，1.293±0.055，1.069±0.042，其中2、3组之间差异显著（P<0.05），与1组相比，2组表达水平明显增高（P<0.05），3组虽略有增高，但无统计学意义（见图1）。表1各组大鼠肠组织MDA水平的变化与1组相比：△P<0.05；与2组相比：*P<0.05 表3  各组大鼠门静脉血浆内毒素水平的变化（±s,EU/ml）与1组相比：△P<0.05；与2组相比：*P<0.05表4  各组大鼠肠绒毛高度的变化与1组相比：△P<0.05；与2组相比：*P<0.05表5  各组大鼠肠黏膜厚度的变化

　　讨  论

    众所周知，入肝血流阻断可造成肝脏损伤，但由于缺血再灌注损伤和血流动力学障碍造成的肝外多器官损伤，却未得到人们重视，特别是肠道损伤［2］。入肝血流阻断时，肠道将遭受淤血性损伤和缺血性损伤，二者都会削弱肠道屏障功能，促进细菌及内毒素移位，进一步导致全身炎症反应综合征（SIRS），甚至多脏器功能不全。因此在肝脏外科中，维护肠道屏障功能，终止或减轻炎症因子的级联反应就显得尤为重要。

    Gln是机体内含量最丰富的条件必需氨基酸，它对维持肠黏膜新陈代谢、结构和功能具有不可替代的作用。然而在入肝血流阻断后，Gln对肠道屏障的作用及机制如何，还未见报道。本研究发现，预防性给予Gln明显减轻了入肝血流阻断后肠道的过氧化损伤，有效保持了肠道组织结构的完整性，降低了内毒素及TNF?α的水平，这从不同角度表明Gln对入肝血流阻断后肠道屏障具有保护作用，可能与Gln为小肠黏膜细胞增殖提供能量及代谢底物、参与抗氧化剂谷胱甘肽的合成等有关。另外，本研究显示再灌注后24小时，肠道组织中的HMGB1mRNA表达显著增高，而Gln具有明显的下调作用。

    HMGB1是细胞核内含量最丰富的非组蛋白染色质蛋白。其产生明显晚于TNF?α、IL?1β等早期细胞因子并持续时间较长，与SIRS及多器官功能障碍等关系密切［3］，特别是在严重创伤或感染时，HMGB1可介导肠屏障功能不全［4］。近来研究提示内毒素引起的死亡可能并非由TNF?α等早期释放的细胞因子所致，而与其后期释放的递质HMGB1有关［5］。除内毒素外，TNF?α、IL?1等炎性因子也可以刺激多种细胞释放HMGB1，HMGB1反过来也可诱导产生TNF?α、IL?1，上述因子相互诱生，相互促进，促使炎症反应不断放大、加重，对组织和器官产生间接损害。HMGB1还具有直接损伤效应。因此本研究结果一方面说明入肝血流阻断促进肠道HMGB1mRNA的表达，后者可能参与了入肝血流阻断后肠道损害的病理生理过程；另一方面更深入地揭示了Gln对入肝血流阻断后肠道损伤的影响机制。Gln对入肝血流阻断后肠道HMGB1mRNA表达的调控，可能与Gln维护肠黏膜屏障，减轻内毒素血症及TNF?α等早期炎症因子的释放有关，而Gln是否可以直接调控HMGB1mRNA的表达，还有待进一步证实。

    综上所述，入肝血流阻断后肠道损伤可能与HMGB1mRNA的表达上调有密切关系，Gln能够减少入肝血流阻断后内毒素移位及炎性因子释放，并且抑制肠道HMGB1mRNA的表达，具有减轻肠道损伤的作用。

【】
  ［1］陈艳平,曹德权,常业恬,等.氯喹对全肝缺血再灌注大鼠肠上皮细胞凋亡及肠道细菌/内毒素移位的影响［J］.中南大学学报(医学版),2006,31:245-248.

［2］刘国平，朱闻溪，杨广顺，等.肝门阻断对肠道屏障相关因子的影响及其意义［J］.医师杂志,2007,9(6):837-838.

［3］Li W,Li J,Ashok M,et al.A cardiovascular drug rescues mice from lethal sepsis by selectively attenuating a late?acting proinflammatory mediator,high mobility group box 1［J］.J Immunol,2007,178(6):3856-3864.

［4］姚永明,刘辉.对高迁移率族蛋白B1作用的新认识［J］.中国危重病急救医学,2005,17(6):385-387.

［5］Wang H,Bloom O,Zhang M,et al.HMG?1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice［J］.Science,1999,285(5425):248-251.