β4整合素结合蛋白调控成纤维细胞胞外基质生成的实验研究
作者：谭江琳，彭旭，袁顺宗，马兵，张小容，胡小红，罗高兴，吴军
【摘要】 目的 探讨β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)对成纤维细胞胞外基质生成的调控作用。方法 分别构建、包装能在哺乳动物细胞中促进和抑制ITGB4BP表达的腺病毒表达载体pAdEasy?ITGB4BP?EGFP和慢病毒表达载体Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BP?RNAi，经筛选鉴定有效后，分别感染人正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕(HTS)成纤维细胞，利用ELISA检测细胞培养上清内基质金属蛋白酶(MMP?9)、转化生长因子?β1(TGF?β1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)的表达情况。结果 正常皮肤成纤维细胞内ITGB4BP高表达后，引起MMP?9、TGF?β1和collagen Ⅰ表达降低;反之HTS成纤维细胞内ITGB4BP表达抑制后，MMP?9、TGF?β1和collagen Ⅰ表达增高。结论 ITGB7BP对MMP?9、TGF?β1和collagen Ⅰ表达具有重要调节功能。提示ITGB4BP可能具有抗纤维化的重要功能，为下一步深入探讨HTS的形成机制提供了重要依据。
【关键词】 β4整合素结合蛋白;腺病毒;慢病毒;成纤维细胞
Abstract: Objective To identify the effect of ITGB4BP(integrin beta 4 binding protein) on the production of extracellular matrix in fibroblasts.Methods The recombinant adenovirus pAdEasy?ITGB4BP?EGFP and Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BP?RNAi were constructed,packaged and amplified in packaging cells,respectively.The primary cultured fibroblast from human normal skin was infected by the recombinant adenovirus pAdEasy?ITGB4BP?EGFP,while the fibroblast isolated from human hypertrophic scar was infected by the Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BP?RNAi.The expression of MMP?9,TGF?β1,and collagen I in cell culture supernatant was detected by ELISA.Results Up?regulated expression of ITGB4BP in human normal skin fibroblast could inhibit the expression of MMP?9,TGF?β1,and collagenⅠ,whereas down?regulated expression of ITGB4BP could promote the expression of MMP?9,TGF?β1,and collagenⅠ in human hypertrophic scar fibroblast.Conclusion ITGB4BP could play an important negative role in the process of production of MMP?9,TGF?β1,and collagenⅠ.Our data suggest ITGB4BP is a new potential target in fibrosis.
Key words:ITGB4BP;adenovirus;lentivirus;fibroblast
增生性瘢痕(hypertrophic scar，HTS)是机体组织受到热力或者其它形式创伤后的一种不良结局，组织学表现为成纤维细胞活化导致胶原和其它细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子过度沉积[1]。在引起HTS的细胞和分子机制的广泛研究中，目前公认的关键事件为处于静息状态的成纤维细胞在转化生长因子?β1(transforming growth factor?β1，TGF?β1)和机械应力的作用下发生表型转化，变为表达α?平滑肌肌动蛋白(smooth muscle cell α?actin,α?SMA)为标志物的肌成纤维细胞(myofibroblast)[2，3]。因此能控制成纤维细胞表型转化和功能变化的信号分子调节途径，是HTS形成机制研究中的焦点问题[4]。在前期实验中我们对HTS和正常皮肤内的差异表达基因进行筛选后，发现P311基因高表达于新生的HTS内[5，6]，随后利用酵母双杂交技术筛选了成人肝文库中能与P311相互作用蛋白的编码序列，经过生物信息学分析、回复性验证和激光共聚焦共定位检测后获得了一个目的基因，其编码的蛋白是：β4整合素结合蛋白(Integrin beta 4 binding protein,ITGB4BP)。因此本实验室构建了高效表达ITGB4BP的重组腺病毒真核表达载体和干扰ITGB4BP表达的RNAi慢病毒表达载体，研究其在成纤维细胞分化中的功能。
材料与方法
1 材料
1.1 细胞、质粒和菌株 人胚胎肾细胞株(HEK293细胞株)、大肠杆菌Ecoli.DH5α、BJ5183(来源于美国ATCC公司)和真核表达载体pEGFP?N2由第三军医大学附属西南烧伤研究所移植免疫组保存;真核表达载体(pITGB4BP?EGFP)由我室前期实验已构建成功;腺病素穿梭质粒(pAdTrack?CMV)购自美国Stratagene公司;腺病素表达载体pAdEasyTM XL Adenoviral Vector System 购自美国Stratagene公司。ITGB4BP基因的慢病毒干扰载体pFIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi和阴性对照由金麦公司定制、构建及测序鉴定。RNA干扰筛选时选用的候选片段分别为：
ITGB4BP RNAi1#?1：AAAGGGGCTGGTGCATCCCAAGA、
ITGB4BP RNAi1#?2：AAAATCTTGGGATGCACCAGCCC;
ITGB4BP RNAi2#?1：AAAGGGCTCAGAGAACTTCTACA、
ITGB4BP RNAi2#?2：AAAATGTAGAAGTTCTCTGAGCC;
ITGB4BP RNAi3#?1：AAAGCAGCCTCCCAGACACAGTG、
ITGB4BP RNAi3#?2：AAAACACTGTGTCTGGGAGGCTG;
Negative Control RNAi?1：AAAGTCGACTCAGTCGGGTGGCA、
Negative Control RNAi?2：AAAACTGCTATCGAGCCTGGCGA
1.2 试剂 DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Promega公司，各种限制性内切酶购自美国NEB、MBI公司，T4 DNA连接酶购自日本Takara公司，脂质体(LipofectamineTM2000)转染试剂盒购自美国InvitrogenTM公司，达尔伯克改良伊氏培养基(DMEM)及新生牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司，总RNA提取试剂(Tripure)购于瑞士Roche公司，实时定量PCR试剂盒[Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)]购于日本toyobo公司，反转录试剂盒(AMV3.0)购于日本TaKaRa公司，实时定量PCR仪(7500 Real Time PCR仪)为美国ABI公司，TGF?β1、MMP?9和Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购于美国RB公司。
2 方法
2.1 pAdEasy?ITGB4BP?EGFP和pAdEasy?EGFP腺病毒的构建、包装、鉴定及扩增 利用限制性核酸内切酶BglⅡ和NotⅠ两个酶切位点，双酶切pEGFP?N2和pITGB4BP?EGFP，从中获得两个目的片段质粒增强型绿色萤火蛋白(EGFP)和带有绿色荧光的ITGB4BP(EGFP?ITGB4BP)，构建至同样被BglⅡ和NotⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle?CMV上。将穿梭质粒转化感受态DH5α大肠杆菌(CaCl2法)，并对获得的阳性克隆重组质粒的菌落进行XhoI酶切鉴定。用Pme I单酶切环状pShuttle?CMV/pITGB4BP?EGFP和pShuttle?CMV/pEGFP?N2真核表达载体，凝胶电泳回收纯化线性化重组质粒，转化含pAdEasy?1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，同源重组获得的两个腺病毒重组载体pAdEasy?ITGB4BP?EGFP和pAdEasy?EGFP利用限制性核酸内切酶Pac I单酶切后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将经Pac I酶切线性化的pAdEasy?ITGB4BP?EGFP和pAdEasy?EGFP质粒用LipofectamineTM 2000转染HEK293包装细胞。转染后第6天收集得到的病毒液即为含目的基因的原代腺病毒液。原代病毒液继续感染HEK293细胞后所获得的病毒液为第2代腺病毒液，继续进行传代感染获得第3、第4代病毒液。
2.2 原代正常皮肤和HTS成纤维细胞的分离与培养 包皮正常成纤维细胞来自本院泌尿外科，HTS成纤维细胞来自我所烧伤后1年内患者。将组织块放入无菌培养皿内，PBS冲洗3遍，无菌剪刀去除表皮和皮下组织部分，剪碎真皮;将剪碎后的组织放入25ml锥形培养瓶内，加入0.5%胰酶10ml，室温，轻微振荡2小时;加入10ml 10%小牛血清DMEM终止消化，将悬液通过无菌滤网过滤后弃去组织碎片;离心，800g/min×10分钟，弃上清，加入10ml 10%小牛血清DMEM洗3遍，再次离心;弃上清后，重悬细胞于10ml 10%小牛血清DMEM中，移至75cm2培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱内进行培养，24小时后更换培养基，同时除去未贴壁细胞。待细胞完全长满后，即可进行传代培养。本实验选用第6～10代成纤维细胞。
2.3 Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi1#2#3#干扰用有效慢病毒的筛选感染HTS成纤维细胞 24孔板HTS成纤维细胞数约为5×103个，每孔加入慢病毒200μl，抽提HTS成纤维细胞的RNA，进行浓度测定后进行反转录反应。反转录反应体系：RNA逆转录酶(AMV Reverse Transcriptase)5μl、RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)2.5μl、三磷酸脱氧核苷复合物(dNTP Mixture)10μl、缓冲液(10×RT Buffer)10μl、随机引物(Oligo dT?Adaptor Primer)5μl、氧化镁(MgCl2)20μl、RNA 5μg、去离子水(ddH2O)42.5μl;反应条件：50℃ 30分钟，99℃ 5分钟、5℃ 5分钟、4℃保存;实时荧光定量PCR检测(Real?time PCR)：cDNA 2μl、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μl、上游引物(10nM) 0.4μl、下游引物(10nM)0.4μl、ddH2O 7.2μl(ITGB4BP上游引物：5'?CCCAACAATACCACCGACCAGGA?3'，下游引物：5'?GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA?3'，内参GAPDH上游引物：5'?GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3'，下游引物：5'?TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG?3')。反应条件：95℃ 2分钟、95℃ 15秒、55℃ 35秒、72℃ 31秒，40个循环，在72℃进行信号采集，并利用7500 system software进行分析。ABI Prism 7500软件分析结果,可得到每个样品的循环数阈值(Ct值)和经内参GAPDH校正的相对量(relative quantity，RQ)值，其中阴性对照的RQ值为1，慢病毒干扰载体1号(1#)、2号(2#)、3号(3#)以此为对照，相应的抑制率：抑制率=(1-慢病毒载体的RQ值÷阴性对照细胞的RQ值)×100%。
2.4 ITGB4BP的表达变化对成纤维细胞上清内ECM的调节作用 24孔板成纤维细胞数约为5×103个。用构建成功的腺病毒pAdEasy?ITGB4BP?EGFP200μl感染正常皮肤成纤维细胞，干扰效果最好的Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BP200μl感染HTS成纤维细胞。3天后利用ELISA试剂盒的操作步骤对MMP?9、TGF?β1、collagen Ⅰ的表达进行检测。
3 统计学分析
ELISA实验中，标准品采用SPSS13.0软件包进行Curve Estimation获得标准曲线，样品则利用其OD450进行One?Way ANOVA分析处理，P≤0.05被认为具有统计学意义。
结 果
1 pShuttle?CMV/pITGB4BP?EGFP和pShuttle?CMV
/pEGFP?N2穿梭载体的构建和鉴定
将构建成功后的pShuttle?CMV/pITGB4BP?EGFP和pShuttle?CMV/pEGFP?N2质粒采用Xho I单酶切后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定(图1)。并把构建成功后的载体经Pme I酶切后、回收，转化含pAdeasy?1的大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，利用Pac I单酶切后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并送上海生工进行测序鉴定，结果与预期相符。
2 pAdEasy?ITGB4BP?EGFP和pAdEasy?EGFP腺病毒的包装、鉴定及扩增
腺病毒载体转染HEK293细胞后，于24小时开始出现荧光，至第5天达到高峰(图2)，细胞逐渐变圆、漂浮。
3 Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi 1#2#3#干扰用有效慢病毒的筛选感染HTS成纤维细胞
Real?time PCR检测结果显示，与阴性对照相比，Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi 2#候选慢病毒几乎完全抑制ITGB4BP的编码基因在mRNA水平上的表达，Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi 3#能够抑制约80%的水平(图3)。根据Real?time PCR结果，后续实验中我们决定采用慢病毒Lentivirus?FIV?H1/U6?copGFP?ITGB4BPRNAi 2#探讨ITGB4BP表达抑制后对HTS成纤维细胞生成ECM的影响。
4 ELISA检测HTS成纤维细胞干扰ITGB4BP表达后ECM的变化
对于ITGB4BP表达抑制后对ECM的调节实验研究，采用HTS成纤维细胞为靶标，利用上一步筛选出的慢病毒2#载体感染HTS成纤维细胞。在此基础上，对MMP?9、TGF?β1和collagen Ⅰ的表达进行了检测。结果为HTS成纤维细胞内ITGB4BP表达干扰后上调细胞培养上清内TGF?β1、MMP?9和collagen Ⅰ的蛋白水平表达(图4、5)。
5 ELISA检测正常皮肤成纤维细胞上调表达ITGB4BP后ECM的变化
在正常皮肤成纤维细胞中强制高表达ITGB4BP后，对MMP?9、TGF?β1和collagen Ⅰ的表达进行了检测。结果为正常皮肤成纤维细胞内ITGB4BP表达增加后下调细胞培养上清内TGF?β1、MMP?9和collagen Ⅰ型的蛋白水平表达(图6、7)。
讨 论
ITGB4BP，又名p27BBP、真核启动因子6(eIF6)，能与整合素亚单位β4(ITGB4)胞浆区发生相互作用[7]。1997年Biffo等[8]运用酵母双杂交技术研究整合素β4与半桥粒形成上的联系时，发现一个蛋白与β4有相互作用，故而命名为ITGB4BP。ITGB4BP蛋白含有245个氨基酸，分子量大小为27kd。其mRNA全长1108bp，其开放读框含有735个核苷酸，该基因的结构域在哺乳动物及非脊椎动物之间高度保守。Ji等[7]发现ITGB4BP可以调节Wnt信号通路中的β?catenin的表达，通过影响细胞骨架发挥调控细胞分化的作用。Chendrimada等[9]还发现ITGB4BP调控蛋白合成还与其对microRNA的调节相关。ITGB4BP与RNA诱导沉默复合体(RISC)相结合，能特异地促进相应microRNA的作用，抑制其对应的靶蛋白表达，反之敲除ITGB4BP后则会解除microRNA对靶蛋白的表达抑制作用而促进靶蛋白表达。
在本实验中我们利用RNA干扰技术抑制HTS成纤维细胞内ITGB4BP的表达后，细胞培养上清内ECM生成相关的TGF?β1、MMP?9和collagencollagen Ⅰ在蛋白水平上明显升高，相反利用腺病毒技术在正常皮肤成纤维细胞内引起ITGB4BP的强制表达后，细胞培养上清内TGF?β1、MMP?9和collagen Ⅰ在蛋白水平上却大大降低。因此，不难看出增生性HTS成纤维细胞内ITGB4BP的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，反过来ITGB4BP的高表达则具有明显的抗纤维化功能，ITGB4BP可能是一个具有强烈作用的HTS形成相关的负调信号。
目前已知的为数不多具有负调纤维化的信号分子，其主要作用的发挥几乎都是通过抑制TGF?β1家族或其下游分子信号途径而实现的，比如活化的AMPK过表达后通过抑制TGF?β1信号途径既能阻断成纤维细胞?肌成纤维细胞转化，又能抑制ECM中collagen Ⅰ、Ⅳ、纤维黏连蛋白(fibronectin)及其ED?A的剪切突变体的表达[10];外源性的血浆纤溶蛋白则通过抑制TGF?β1信号途径，与ECM蛋白降解、成纤维细胞凋亡之间产生一具有时间和剂量依赖性的关系[11];同样外源性的PLAB则通过抑制TGF?β1下游的Smad信号途径从而抑制HTS成纤维细胞的增殖，促进其凋亡而发挥抗纤维化作用[12];内源性的PTEN抗纤维化的功能同样亦是通过抑制TGF?β1而实现抑制成纤维细胞?肌成纤维细胞转化、增殖和胶原生成;HTS ECM内follistatin呈低表达，外源性加入follistatin则具有通过抑制TGF?β1家族中的activin A而抑制HTS成纤维细胞增殖和胶原生成的作用[13]。我们在实验中检测出的纤维化负调分子ITGB4BP则低表达于HTS成纤维细胞内，并且成纤维细胞内ITGB4BP的高表达则能明显抑制TGF?β1与ECM的生成。因此提示ITGB4BP作为一个新的HTS成纤维细胞内与纤维化相关的内源性负调分子，如能深入揭示其对增生性瘢痕成纤维细胞表型和功能的调控作用和分子机制，将有助于从细胞内信号分子角度进一步丰富HTS形成的病理机制。
【】
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