高迁移率蛋白B1与活化T细胞核因子2协同促进白细胞介素?2报告基因转录表达
作者：刘辉，姚咏明，丁丽华，王晓辉，袁斌，宋青，叶棋浓，黄翠芬，盛志勇
【摘要】 目的 探讨高迁移率蛋白B1(HMGB1)促进白细胞介素(IL)?2转录表达免疫效应的分子机制。方法 构建HMGB1和活化T细胞核因子2(NFAT2)的真核表达质粒，分别单独转染以及共同转染人胚胎肾细胞系293T、人子宫颈癌细胞系Hela，同时转染IL?2报告基因，检测IL?2报告基因的表达活性。观察当HMGB1与NFAT2质粒共同转染细胞时，是否能协同促进IL?2报告基因的活性。结果 在293T细胞中，HMGB1或NFAT2单独转染可提高活性倍数相加为6.8倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组相比提高了18.4倍。在Hela细胞中，二者单独转染可提高活性倍数相加为49.9倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组相比提高了117.7倍。结论 HMGB1可与NFAT2可协同促进IL?2报告基因转录表达。
【关键词】 高迁移率蛋白B1;活化T细胞核因子;白细胞介素?2;免疫
Abstract: Objective To investigate the molecular mechanism of interleukin(IL)?2 production facilitated by high mobility group box?1 protein(HMGB1).Methods Eukaryotic expression plasmid HMGB1 and nuclear factor of activated T cells?2(NFAT2) were transfected into 293T or Hela cells respectively or simultaneously.Reporter gene activity of IL?2 was detected and compared.Coordinate regulation between HMGB1 and NFAT2 was examined.Results Reporter gene activity of IL?2 increased by 6.8 times induced by solo?transfection of HMGB1 or NFAT2 in 293T cells，while increased by 18.4 times induced by co-transfection of HMGB1 and NFAT2 in 293T cells.On the other hand, reporter gene activity increased by 49.9 times induced by solo?transfection of HMGB1 or NFAT2 in Hela cells,while increased by 117.7 times by co?transfection of HMGB1 and NFAT2.Conclusion HMGB1 acts as a coactivator of NFAT2 in promoting IL?2 transcription.
Key words:high mobility group box?1;nuclear factor of activated T cell;interleukin?2;immunity
高迁移率族蛋白B1(high mobility group box?1 protein,HMGB1)是一大类高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，不仅广泛存在于真核细胞的细胞核内，对DNA复制、转录、重组和修复具有重要作用，而且可作为一种新的“晚期”炎症递质由单核/巨噬细胞分泌到细胞外参与炎症反应[1，2]。新近研究表明，HMGB1不仅与创伤后炎症反应密切相关，还可作为一种免疫调节因子引起淋巴细胞激活并释放白细胞介素(IL)?2，诱导树突状细胞活化并分泌IL?12[3，4]。我们前期实验证实，重组HMGB1可诱导淋巴细胞凋亡，并影响活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)的入核启动基因转录和IL?2表达[4]。但是，关于HMGB1以何种机制影响T淋巴细胞合成释放IL?2还不明确，其确切信号转导途径尚缺乏研究。由于NFAT2是淋巴细胞内控制IL?2表达的关键调控因子[5]，本实验中笔者构建HMGB1和HMGB1的真核表达质粒，与IL?2报告基因共同转染细胞系，探讨NFAT2能否介导HMGB1促进IL?2表达的免疫效应。
材料与方法
1 主要试剂
真核表达载体pcDNA3、人乳腺文库、大肠杆菌DH5α菌株及含Flag标签的pcDNA3质粒由军事医学院八所七室保存;含人全长NFAT2的质粒由华盛顿大学Feng Chen博士惠赠;荧光素酶检测试剂盒、T4噬菌体DNA连接酶及微量质粒提取试剂盒(Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System)购自美国Promega公司;小鼠抗人HMGB1抗体购自美国Sigma公司;免疫发光检测试剂盒购自美国Pierce公司;转染试剂Lipefectmine2000购自美国Invitrogen 公司。
2 基因序列
在Medline的GenBank数据库中获取人HMGB1的基因全长，基因库登录号为BC066889，其开放读码框从80～727位。NFAT2的基因全长序列在GenBank中基因登录号为U08015，其开放读码框从240～2390位[6]。
3 细胞转染
培养人肾胚胎细胞系293T以及人宫颈癌细胞系Hela细胞，细胞用含有10%的新生牛血清和双抗DMEM培养基培养。在转染前24小时用不含双抗、含10%新生牛血清的相应培养基将细胞接种在12孔板中，接种量以转染时细胞密度达到90%为准。将DNA用80μl不含双抗和血清的培养基稀释，再用80μl相同的培养基稀释2.5μl Lipofectamine2000，立即将二者混合，室温放置20分钟后，加入到含有0.8ml培养基和10%新生牛血清的12孔板中，4小时后更换培养基。
4 荧光素酶和β?半乳糖苷酶(β?gal)活性测定
基本按Promega公司提供的试剂盒说明进行。细胞转染24小时后，裂解细胞离心(12000r/min，10分钟，4 ℃)，取上清液测定荧光素酶活性。
采用邻?硝基苯?β?D?半乳糖苷测定β?gal活性。取上述上清液10μl加入到450μl含有β?巯基乙醇(2.7ml/L)的缓冲液中，加入100μl 0.4%的邻?硝基苯?β?D?半乳糖苷溶液，37 ℃保温，直到出现浅黄色为止，加入250μl 1mol/L Na2CO3终止反应，在420nm波长下测定样品A值。
5 Western blot检测细胞中HMGB1及NFAT2的表达
细胞在测定荧光素酶活性时首先用Promega公司的裂解液提取上清，吸取10μl上清，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后进行转膜，电转完毕后取出硝酸纤维素膜，应用特异性抗体及带荧光素酶的二抗进行结合。在暗室中，采用化学发光反应试剂盒进行检测。
6 实验分组及过程
12孔板内的293T细胞生长密度达到90%满足转染要求时，将8孔细胞随机分为4组。每组有2孔细胞，其中1孔不加刺激，另1孔在质粒转染完毕后加入佛波酯A(PMA,终浓度为25ng/ml)+屋诺霉素(Iono,终浓度为0.5μM)刺激[7]。各孔转染的质粒用量为pcDNA3或pcDNA3?HMGB1 0.2μg/孔，带Flag标签的真核表达载体(pcDNA3?Flag)或带Flag标签的pcDNA3?NFAT2真核表达质粒(pcDNA3?Flag?NFAT2)为0.05μg/孔。所有孔含IL?2启动子的NFAT2荧光素酶报告基因质粒(NFAT2?luciferase)的用量为0.1μg/孔，β?gal的用量为0.05μg/孔，Lipofectamine 2000的用量为1μl/孔，分组如下：第1组为阴性对照，加入对照质粒;第2组为NFAT2转染组，加入NFAT2表达质粒;第3组为HMGB1转染组，加入HMGB1表达质粒;第4组为共转染组，加入HMGB1和NFAT2表达质粒。pcDNA3和pcDNA3?Flag为对照质粒，用于阴性组及各组质粒补平。各组转染体系体积为50μl，不足用生理盐水补足。
Hela细胞转染时的分组与293T细胞相同，但转染质粒用量稍有增加。各孔转染的质粒用量为pcDNA3或pcDNA3?HMGB1 0.4μg/孔，pcDNA3?Flag或pcDNA3?Flag?NFAT2为0.1μg/孔。所有孔的NFAT2?luciferase的用量为0.1μg/孔，β?gal的用量为0.1μg/孔，Lipofectamine 2000的用量为1.2μl/孔。
按照统计学要求，上述各组实验重复4次。
7 统计学处理
所有试验数据以平均值±标准差(±s)表示，采用stata4.0统计软件，进行单因素方差分析。P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。
结 果
1 构建HMGB1及NFAT2真核表达质粒
从人乳腺文库中钓取HMGB1全长，克隆到pcDNA3载体中;并从Flag?NFAT2质粒中扩增出NFAT2全长，克隆到带Flag标签的pcDNA3载体中，并通过基因扩增、酶切(数据未显示)和蛋白表达鉴定。将pcDNA3?HMGB1质粒与Flag?pcDNA3?NFAT2质粒分别转染293T细胞，用抗HMGB1抗体检测HMGB1蛋白表达，用Flag抗体检测Flag?NFAT2融合蛋白表达，并分别设阴性对照。结果显示(图1)，pcDNA3?HMGB1质粒与Flag?pcDNA3?NFAT2质粒在293T细胞中都表达目的蛋白，而阴性对照均未表达。通过以上的鉴定试验，可初步确定HMGB1与NFAT2的真核表达质粒构建正确，最后将2个质粒送测序，测序结果回报，所测序列与GenBank中的基因序列完全相符。
2 293T细胞中的活性检测及蛋白表达
将构建好的pcDNA3?HMGB1质粒与pcDNA3?Flag?NFAT2质粒分别单独转染以及共同转染293T细胞，同时转染IL?2报告基因，检测IL?2报告基因的表达活性。观察当HMGB1与NFAT2质粒共同转染细胞时，是否能协同促进IL?2报告基因的活性。
转染后24小时收集细胞，应用裂解后的上清作活性及蛋白表达检测，结果显示非刺激组活性均无显著增加，只有应用PMA+Iono刺激时可提高报告基因的转录活性。HMGB1、NFAT2单转时提高活性分别为4.4、2.4倍，而共同转染时报告基因活性上升的幅度较大，与未刺激对照组相比提高了18.4倍。(图2、图3)。
3 Hela细胞中的活性检测及蛋白表达
Hela细胞是宫颈癌细胞系，转染效率比293T细胞稍低，所以转染的质粒用量略有增加。其转染步骤及分组与293T细胞实验组相同。转染后24小时作活性及蛋白表达检测，结果显示HMGB1单转时也可显著提高活性，但不如共同转染时活性上升的幅度大，HMGB1与NFAT2质粒共同转染时报告基因活性可提高117.7倍(图4、图5)。
讨 论
新近的资料证实，HMGB1可作为机体内一种信号动员免疫系统活化，例如促进树突状细胞成熟、诱导T细胞分泌IL?2和干扰素?γ从而发生Th1极化[4,8,9]，但HMGB1是通过何种途径促进IL?2表达分泌的呢?这方面尚缺乏相应的研究，本实验首次探讨了HMGB1诱导IL?2合成释放的分子机制。
业已明确，NFATs是淋巴细胞活化中关键的信号分子家族，被T细胞受体信号活化后，转位入核内调控重要基因转录表达。NFAT蛋白在静息状态下位于T淋巴细胞胞浆中，高度磷酸化，活化时被钙调蛋白依赖性磷酸酯酶(calcineurin)作用而发生去磷酸化，移位入细胞核，调节诸如IL?4、IL?2、IL?5、IL?13、GM?CSF、IL?3、TNF?α等重要免疫分子的表达[5,10]。迄今为止，NFATs家族已发现有5个成员，包括NFAT1(NFATp,NFATc2)、NFAT2(NFATc1,NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3,NFATx)及NFAT5(TonEBP,tonicity element binding protein,紧张片断结合蛋白)。NFAT1?4是由钙调节的，与细胞的免疫调节反应关系密切;NFAT5相对原始，是NFATs家族中唯一可在果蝇基因组中找到的，NFAT5在细胞对高张渗透压刺激的信号转导中扮演关键角色。成熟的T淋巴细胞主要表达NFAT1、NFAT2，如果抑制NFAT1/2的水平，淋巴细胞则会基本失去合成释放免疫分子的能力[11]。NFAT1?4的DBD区(DNA bind domain)都可以与IL?2的NFAT启动子区域结合，同时结合激活蛋白(AP)?1[12]。
研究表明，HMGB1与NFAT2存在一些共同的相互作用蛋白。已证实，HMGB1可作为雌激素受体?α(estrogen receptor?α,ER)的共激活蛋白促进ER的转录活性，从而启动下游基因转录表达。HMGB1蛋白可以显著促进ER与雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)的结合。既往研究表明，NFAT家族成员可与ER直接结合并相互影响信号通路[13]。因此，有理由推测HMGB1可能与NFAT发生直接相互作用。另有资料显示，一种HMGB1/2家族中DNA结合蛋白成员——DSP1(DSP1中含有与HMG序列相似的结构域)，可与Rel同源域家族成员发生相互作用[14]。而NFATs结构中含有Rel相似结构域，结构上的特点提示二者可能直接相互作用。
本实验结果显示，无论在293T细胞还是在Hela细胞中，只有当HMGB1与NFAT2共同转染时，才能获得报告基因的最大活性。而且，所获得的最大活性超过了单独转染时所获得活性的简单相加，提示HMGB1和NFAT2可协同促进IL-2报告基因的表达活性。在293T细胞中，二者单独转染可提高活性倍数相加为6.8倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组性比提高了18.4倍。同样，在Hela细胞中二者单独转染可提高活性倍数相加为49.9倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组性比提高了117.7倍。因此，HMGB1可能通过促进NFAT2的转录活性从而增强IL?2的表达释放。此外，本实验应用PMA和屋诺霉素充分活化NFATs，因为PMA可激活丝裂原活化蛋白激酶途径从而活化AP?1。AP?1是NFATs重要的共作用因子，NFAT1?4与DNA结合时同时与AP?1形成牢固的复合体，共同调控基因转录。屋诺霉素则是钙离子的转运载体，可促进钙离子内流，活化钙依赖性NFATs激活通路。因此，在本实验中我们应用25 ng/ml PMA+0.5μM Iono作为刺激剂，充分活化NFATs，以观察对IL?2报告基因活性的影响。
已证实，HMGB1可作为多种转录因子的共激活因子，HMGB1可促进雌激素、雄激素及糖皮质激素受体的DNA结合能力，只要加入少量提纯的HMGB1，这些受体结合相应DNA序列的能力就会明显增强。HMGB1可以与某个激素受体、相应的DNA序列形成三元复合体，帮助这些转录因子结构变形，便于与相应的DNA片段相结合，从而成倍的增强激素受体的转录活性。从这一点看，HMGB1所起的作用类似于支架蛋白(scaffold protein)，可帮助DNA片段与转录因子相互结合并处于功能位置。且体外实验证明，HMGB1能与激素受体短暂结合[15]，包括黄体酮激素受体、雌激素受体和雄激素受体等。因此，HMGB1可作为这些转录因子的伴侣蛋白或者伴侣分子，帮助其结合到相应的DNA片段上，一旦完成任务，HMGB1即脱开解构。在这种方式中，HMGB1有可能先与基因序列结合再帮助转录因子结合进来;或者存在另一种作用方式，转录因子先与DNA片段形成复合物，HMGB1接着再加入进来形成蛋白?DNA复合物或者蛋白?蛋白复合体。然而，在本实验中二者通过何种机制相互作用，其作用位点在哪?笔者将在今后的实验中进一步探讨。
【】
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