成纤维细胞生长因子受体3在脂多糖抑制成骨细胞分化中作用的初步研究

                    作者：杨京，赵子瑜，何启芬，陈林

【摘要】  目的 本实验拟通过研究激活成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)信号通路时骨组织成骨细胞分化程度在内毒素血症中的变化，为进一步阐明骨组织在炎症反应中变化的机制奠定基础。方法 8周龄雄性C57小鼠和FGFR3功能持续增强的软骨发育不全(Ach)小鼠各6只，分为脂多糖(LPS)组和生理盐水对照组，每组3只。LPS 15mg/kg或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧胫骨提取RNA，定量聚合酶链式反应(PCR)检测白细胞介素?6(IL?6)、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)、骨钙素(OC)的变化。LPS、碱性成纤维生长因子(bFGF)处理前成骨细胞系MC3T3E1 4小时后定量PCR检测IL?6、TNF?α、OC水平，成骨诱导7天后检测碱性磷酸酶(ALP)活性。结果 LPS刺激后，骨组织和MC3T3E1的炎症递质基因IL?6、TNF?α的RNA水平显著增加(P<0.01)，成骨标志性基因OC表达下调(P<0.05)。且Ach小鼠相应基因变化幅度显著高于C57的变化幅度(P<0.05)。MC3T3E1同时用LPS与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理组的IL?6、TNF?α、OC水平表达水平位于单独用LPS或bFGF组之间。成骨诱导7天后LPS处理组细胞ALP活性显著低于未处理组(P<0.05)，bFGF处理组显著增高(P<0.01)。结论 LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应，在细胞水平低剂量bFGF激活FGFR3减轻上述反应。

【关键词】  脂多糖;骨;成骨细胞;成纤维细胞生长因子受体3

　　Abstract： Objective This experiment focuses on the differentiation of osteoblasts in the endotoximia while the FGFR3 pathway is activating,so as to understand the change of bone tissue in inflammation.Methods Six male C57 mice and 6 male Ach mice (persistently activating function of FGFR3),8 weeks old,were divided into normal saline(NS) group and lipopolysaccharide(LPS) group,3 mice per group.RNA was extracted from the right tibias 4 hours after LPS or physiological saline injection,and then the levels of interleukin 6(IL?6),tumor necrosis factor α(TNF?α),osteocalcin (OC) in tibia and osteoblast were measured by quantitative real?time PCR.Four hours after the preosteoblast cell line MC3T3E1 was cultured with LPS and bFGF,the levels of IL?6,TNF?α,OC in tibia and osteoblast also were measured by quantitative real?time PCR.The MC3T3E1 activities of alkaline phosphatase(ALP) were detected 7 days after culture.Results Both of the levels of IL?6 and TNF?α in tibias and MC3T3E1 were increased while the levels of OC in tibias and MC3T3E1 were decreased 4 hours after LPS administration(P<0.01).The expression change was more huge in Ach mice(P<0.05).The expressions of IL?6,IL?1 and OC in MC3T3E1 cultured with LPS and bFGF were higher than those cultured only with LPS and lower than those only with bFGF.Compared with the untreated group,the activity of ALP in MC3T3E1 was decreased in LPS group(P<0.05) and increased in bFGF group(P<0.01).Conclusion LPS could involve bone tissue in inflammation and inhibit the differentiation of osteoblast.Persistently activating the function of FGFR3 in vivo could aggravate these effects.And low dose of bFGF in vitro which activates FGFR3 could relieve these effects.

　　Key words：LPS;bone;osteoblast;FGFR3

　　脂多糖(LPS)是脓毒症中主要致病菌革兰阴性菌的主要致病成分。LPS可引起多种脏器损伤、功能紊乱甚至衰竭。但骨骼在LPS引起的内毒素血症中的变化和发生机制尚未完全阐明。我们在前期的研究中利用全基因组基因芯片扫描发现，LPS注射4小时后小鼠骨组织中成纤维生长因子受体3(FGFR3)表达显著下调。有研究发现成年期FGFR3敲除小鼠骨质减少，并且体外培养的骨髓间充质细胞向成骨分化增强[1]。这提示FGFR3可负性调节成骨细胞的分化。但有文章发现在细胞培养实验中LPS抑制成骨细胞的分化[2]。那么LPS引起的FGFR3表达下降是否为机体的代偿反应?本实验将通过在动物、细胞水平增强FGFR3信号通路后检测LPS刺激下成骨细胞分化的变化，以初步明确FGFR3信号通路在骨组织对LPS反应中的作用，为进一步阐明骨组织在炎症反应中的变化奠定基础。
　　
　　 材料与方法

　　1 动物分组

　　8周龄雄性C57小鼠和Ach小鼠各6只，分为LPS组和生理盐水(NS)对照组，每组3只。LPS 15mg/kg (Sigma)或等量生理盐水腹腔注射4小时后取右侧全长胫骨，剔除肌肉、软组织后液氮保存备用。

　　2 细胞培养

　　前成骨细胞系MC3T3E1(购自北京协和细胞库)以含10%FBS(GIBCO)的α?MEM(GIBCO)培养至融合后，以LPS 100ng/ml(sigma)、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(BD)、LPS100ng/ml+bFGF 10ng/ml分别处理细胞4小时后搜集细胞备用。另取融合细胞用成骨诱导液培养：含50μg/ml维生素C (sigma)、10mmol/L β磷酸甘油钠(sigma)、100nmol/L地塞米松(sigma) 的完全培养基。以100ng/ml LPS、bFGF10ng/ml、LPS100ng+bFGF10ng/ml分别处理7天后搜集细胞备用。每组实验重复2次，相同培养条件下以不加任何处理因素的细胞作为空白对照。

　　3 定量聚合酶链式反应(PCR)

　　将相应时间点所取的上述胫骨组织和培养细胞以Trizol法提取总RNA。紫外分光光度仪测取RNA浓度，取1μg总RNA为模板,参照逆转录试剂盒(Exscript,TAKARA)的说明书进行逆转录反应。cyclophilin A、白细胞介素?6(IL?6)、肿瘤坏死因子α(TNF?α)、骨钙素(OC)引物由上海生工生物工程公司合成(表1)。PCR反应体系配制及扩增条件设置参照定量PCR反应试剂盒说明书进行(SYBR Primer Ex Taq kit,TAKARA)。最后，由定量PCR仪(Mx3000P)自动给出c(t)值和目的基因的相对含量。

　　4 碱性磷酸酶(ALP)活性检测

　　参照ALP活性检测试剂盒(sigma)进行。成骨诱导7天细胞以裂解液：10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris?HCl)，2mM氯化镁，0.05% Triton X?100(pH8.2)裂解后吸取30μl上清加入至300μl ALP活性测定液中，颠倒混匀后在37℃反应30分钟，加入1ml 0.1N的NaOH中止反应，测定405nm的吸光值，以0.4N的HCl作对照。同时吸取30μl上清加入至70μl生理盐水中，然后加入1ml BCA工作液，混匀后37℃反应30分钟，测定562nm的吸光值，以100μl生理盐水作对照。每个样品取其OD405/OD562的比值做统计分析。

　　5 统计分析

　　使用SPSS10.0统计软件，采用One?Way ANOVA Tukey法比较组间差异，以P<0.05为差异显著。表1 定量PCR引物序列

　　结 果

　　1 FGFR3在LPS引起的炎症反应中的作用

　　LPS刺激后，与生理盐水组比较，胫骨组织和MC3T3E1细胞的炎症递质基因TNF?α、IL?6的表达水平显著增加(P<0.01)(图1)。且Ach小鼠胫骨组织LPS处理后TNF?α、IL?6的表达水平增幅显著高于C57的变化幅度。bFGF处理MC3T3E1细胞4小时后其TNF?α、IL?6表达水平略有增加，同时用LPS与bFGF处理后其IL?6、TNF?α水平表达水平有所增加，但低于单独用LPS处理组(图1)。

　　2 FGFR3在LPS引起的成骨细胞分化抑制中的作用

　　LPS处理后胫骨组织和MC3T3E1细胞的成骨标志性基因OC表达显著低于生理盐水组(P<0.01)。Ach小鼠胫骨组织LPS处理后OC表达水平下降幅度显著高于C57小鼠的降幅(图2a)。bFGF处理MC3T3E1细胞4小时后其OC表达水平显著高于空白对照组(P<0.01)，同时用LPS与bFGF处理后其OC水平表达水平增加(P<0.01)，但略低于单独用bFGF处理组的表达水平(图2b)。

　　成骨诱导7天后，与空白对照组的ALP活性比较，LPS处理细胞下降(P<0.05)，bFGF处理组显著增高(P<0.01)，同时用LPS与bFGF处理组虽略低于单独用bFGF处理组的ALP活性但仍显著高于空白对照(P<0.01)(图2c)。
　
　　讨 论

　　近年来研究发现骨骼不仅是人体的支撑结构，其更重要的功能是作为一种内分泌免疫器官调节全身内环境的稳定。成骨细胞可通过分泌OC调节体内血糖水平[3]。炎症反应时成骨细胞在多种炎症因子的刺激下会产生各种细胞因子，如高迁移率组蛋白B1(HMGB1)、IL?6、激活核因子NF-κB 受体的配体(RANKL)等，参与免疫应答[4]。另外成骨细胞的分化成熟与造血干细胞增生密切相关。表达于幼稚成骨细胞的骨桥蛋白(OP)可帮助造血干细胞定位于骨内膜表面，负性调节其更新[5，6]。因此，研究骨骼在内毒素血症情况下的变化可能对机体的预后和转归具有重要的意义。

　　我们在前期的研究中利用全基因组基因芯片扫描发现，LPS注射4小时后小鼠骨组织中FGFR3表达显著下调。FGFR3是受体酪氨酸激酶家族成员之一，它与其相应配体FGFs结合后通过多种信号通路如丝裂原活化蛋白酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、信号转导和转录激活因子1(STAT1)等调节细胞的增生、分化和凋亡。FGFs/ FGFRs信号已经被证实在骨骼发育过程中发挥非常重要的作用。因此，在本实验中我们使用持续激活FGFR3的Ach小鼠观察其成骨细胞分化对LPS的反应性变化。发现LPS刺激后，Ach小鼠胫骨组织中炎症因子基因表达的增高幅度和成熟成骨细胞标志基因OC的下降幅度均高于野生型小鼠。即持续激活FGFR3可促进LPS导致的骨组织炎症因子生成增加和成骨细胞分化抑制。FGFR3主要的下游通路之一MAPK通路，包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38，C?jun氨基末端激酶(JNK)3个成员。其中，p38也是LPS?Toll样受体4(TLR4)通路的下游通路之一。LPS激活细胞表面的TLR4后通过p38进一步激活NF?κB启动下游基因转录。这提示FGFR3可能是通过激活p38通路进一步促进LPS引起的炎症分子高表达。在我们前期的研究中发现FGFR3可通过磷酸化ERK1/2抑制OC的表达。由此推论，LPS抑制FGFR3的表达后应该出现OC的升高，但却出现OC表达的下降。这可能是由于LPS通过FGFR3以外的信号通路发挥作用的缘故。

　　另外，我们还发现低剂量的bFGF，FGFR3的一个相对特异的配体，可促进前成骨细胞系中OC表达增加、ALP活性增加。ALP是成骨细胞分化的早期标志性基因，是成骨细胞的标志性酶，ALP的活性在一定程度上反映了细胞的成骨能力。这提示低剂量的bFGF可促进成骨细胞的分化。这种FGFR3信号在体外实验中抑制LPS引起的成骨细胞分化降低和在整体水平中加重LPS引起的成骨细胞分化抑制似有矛盾之处。有报道，bFGF低剂量和较高剂量存在相反的作用[7]。这种体内外的不同结果也可能是由于Ach小鼠是从胚胎期就开始持续激活了FGFR3的表达，影响了小鼠成骨细胞的发育过程。因此，我们计划下一步利用可诱导的增强/敲除技术在正常发育的成年期小鼠增强/敲除FGFR3后研究其成骨细胞对LPS反应性的变化，以排除异常发育的影响。

　　综上所述，我们发现LPS刺激骨组织发生炎症反应、抑制成骨细胞分化。在整体动物水平持续性激活FGFR3信号通路加重上述反应，在细胞水平低剂量激活FGFR3减轻上述反应。FGFR3这种复杂的作用有待于我们进一步深入研究，以助于揭示LPS对骨组织的作用机制，为寻找新的脓毒症防治措施提供线索。

【文献】
  　　[1]Valverde?Franco G,Liu H, Davidson D,et al.Defective bone mineralization and osteopenia in young adult FGFR3-/-mice[J].Hum Mol Genet,2004，13(3):271-284.

　　[2]Kadono H,Kido JI,Kataoka M,et al.Inhibition of osteoblastic cell differentiation by lipopolysaccharide extract from porphyromonas gingivalis[J].Infection and Immunity,1999,67(6):2841-2846.

　　[3]Lee NK,Sowa H,Hinoi E,et al.Endocrine regulation of energy metabolism by the skeleton[J].Cell,2007,130(3):456-469.

　　[4]Elefteriou F,Ahn JD,Takeda S,et al.Leptin regulation of bone resorption by the sympathetic nervous system and CART[J].Nature,2005,434(7032):514-520.

　　[5]Nilsson SK,Johnston HM,Whitty GA,et al.Osteopontin, a key component of the hematopoietic stem cell niche and regulator of primitive hematopoietic progenitor cells[J].Blood,2005,106(4):1232-1239.

　　[6]Stier S,Ko Y,Forkert R,et al.Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size[J].J Exp Med,2005,201(11):1781-1791.

　　[7]Sakano S,Hasegawa Y,Murata Y,et al.Inhibitory effect of bFGF on endochondral heterotopic ossification[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,293(2):680-685.