诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺组织的神经与血管支配研究
作者：付小兵，孙同柱，雷永红，包晓霞，张翠萍，盛志勇
【摘要】 目的 研究诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺组织后的神经与血管分布特征，以确认再生汗腺组织是否受到新生神经的支配和新生血管的血液供应，进而评价再生汗腺组织的质量。方法 选择烧伤后行瘢痕切除术患者4例。每例患者均设创面自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植和对照两个部位。移植部位在瘢痕切除的创面上接种经过诱导的MSCs,而对照部位除未接种MSCs外，其余方法同创面。术后3个月在移植部位和对照部位分别进行发汗试验。在移植部位发汗试验呈阳性处取材，同时取对照部位的组织和术中切下的瘢痕组织。采用免疫组织化学二步法检测所取组织标本的S?100蛋白(S?100)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、八因子相关抗原( Ⅷ?R Ag )和CD34的表达，并与正常皮肤作比较研究。结果 4例创面移植部位发汗试验均呈阳性,对照部位发汗试验阴性。免疫组织化学检测显示移植部位的真皮浅层有结构类似于正常汗腺的组织团块，而对照部位未观察到类似结构。S?100、NSE、Ⅷ?R Ag 和CD34在移植部位、对照部位、瘢痕组织以及正常皮肤均有表达，并且S?100、NSE、Ⅷ?R Ag和CD34在移植部位再生汗腺组织中的分布与在正常皮肤汗腺组织中的分布极其相似。结论 诱导骨髓间充质干细胞再生汗腺的组织中均有神经与血管分布，提示形成具有功能的汗腺组织可能受到新生神经的支配和新生血管的血液供应，骨髓间充质干细胞经诱导可以生成形态和功能较好的汗腺组织。
【关键词】 汗腺;干细胞;S?100蛋白;神经元;烯醇化酶;抗原
Distribution of nerve and blood vessels in regenerative sweat glands
Abstract： Objective To explore the distribution characteristics of nerve and blood vessels in regenerative sweat glands induced from bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and confirm whether these sweat gland tissues are dominated by the newborn nerve and blood vessels.Methods Four postburn patients who were operated with scar excision were enrolled in this study.The scars were excised and two parts of these excised wounds were identified in every patient.One of them was used as the transplant and the other one taken as was taken the contrast.The induced MSCs which were co?cultured with sweat gland cells were implanted into scar?cut part.Then they were covered with a piece of cellular allogeneic dermis.The wounds in the control part were treated with the same procedures,but without cell implantation.Perspiration test with iodine and starch was made after 3 months and the biopsy was taken from the transplanted areas and control areas.The immunohistochemistry was used to test the expression of S?100(S?100),neuron specific enolase(NSE),factor Ⅷ related antigen (Ⅷ?R Ag) and CD34.The expression of these factors in normal skin and scar tissue was also examined and used as control.Results The perspiration test on the transplanted area was positive,but negative in the control parts in four patients.Immunohistochemical examination confirmed that the positive expression of S?100,NSE,Ⅷ?R Ag and CD34 could be found in tissues taken from the transplanted area,control parts,normal skin and scar tissues.Furthermore,the distributions of S?100,NSE,Ⅷ?R Ag and CD34 on the transplanted areas were similar to those on the normal skin.Conclusion The regenerative sweat glands from the induced MSCc have the distribution of the nerve and blood vessels and these functional sweat gland tissues may be dominated by the newborn nerve and blood vessels.
Key words:sweat glands;stem cells;S?100;neuron;enolase;antigen
我们前期的工作证明，将汗腺细胞与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)进行共培养，在体外可以成功诱导MSCs向汗腺细胞表型分化。在此基础上，将具有汗腺细胞表型的MSCs自体移植于患者切除瘢痕创面上,可以再生出汗腺样结构并且具有类似于正常皮肤的发汗功能[1]。在再生汗腺部位取组织活检，行组织学与免疫组织化学检查，结果显示在移植经过诱导的MSCs创面愈合部位真皮浅层有大量汗腺细胞表面标志物，即癌胚抗原(CEA) 染色阳性细胞,在某些区域这些阳性细胞分布较为集中,形态与汗腺组织相似,而对照创面愈合组织与术前切除的瘢痕组织中均未见CEA阳性染色细胞。在此基础上，作者又进一步研究了再生汗腺组织中S?100蛋白(S?100)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、八因子相关抗原(Ⅷ?R Ag )和CD34的表达，以探讨再生汗腺组织是否受到新生神经的支配和新生血管的血液供应，进一步评价再生汗腺组织的质量。
材料与方法
1 一般资料
选择移植经诱导MSCs再生汗腺术后3个月患者4 例(男性1例，女性3例)，年龄12～21岁。移植部位分别为上臂、胸部、手部和颈部。每例移植患者创面分为移植和对照两个部位。移植部位在切除瘢痕的创面上接种自体经过诱导的MSCs,而对照部位除在切除瘢痕的创面上未接种MSCs外，其余治疗方法相同。所有MSCs移植病例与创面取材均经过伦理委员会批准和患者知情同意。
2 诱导MSCs表型改变与移植
MSCs与汗腺细胞共培养和诱导分化以及移植方法均按照1描述的方法进行。大致步骤概括如下：取患者骨髓2ml,采用直接贴壁法培养MSCs。同时取患者正常皮肤1～2cm2，用Ⅱ型胶原酶(2mg/ml)消化后，分离培养汗腺细胞。培养后的汗腺细胞放入47 ℃环境中40分钟,行热休克处理,室温下冷却。加入MSCs，进行MSCs与汗腺细胞的共培养。3天后收集共培养的细胞用于移植。患者在麻醉条件下，切除瘢痕组织，将共培养细胞悬液涂抹于创面,应用去细胞多孔异体真皮基质覆盖其上，在真皮基质上移植自体微粒皮,最后用异体皮覆盖于微粒皮表面。对照创面除不进行共培养细胞移植外，其余步骤与移植创面相同。
3 发汗试验及标本留取
自体干细胞移植再生汗腺术后3个月，对患者的移植创面和对照创面行碘淀粉发汗试验。试验方法是将碘酒涂抹于被检测创面，充分晾干5分钟后，在创面均匀铺撒淀粉，使创面与淀粉充分接触。给患者饮用热开水促其发汗，此时被检测创面出现蓝黑色为发汗试验阳性，不变色则为阴性。在移植创面发汗试验呈阳性的部位取3mm×3mm×3mm大小组织，同时取患者的对照创面组织，瘢痕组织和正常皮肤，共4组标本。所有标本经10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，组织连续5μm切片、烤片，然后行免疫组织化学染色。
4 免疫组织化学染色
采用免疫组织化学即用型二步法(非生物素)检测试剂盒。该试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。所需一抗(S?100、NSE、Ⅷ?R Ag 和CD34抗体)均购自Santa Cruz公司。实验操作按说明书进行。组织切片经脱蜡、水化后，3%过氧化氢孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶。0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，5分钟×3次。抗原热修复，滴加一抗，室温30～60分钟，PBS冲洗，2分钟×3次。滴加山羊抗小鼠(或兔)IgG抗体?HRP多聚体，20分钟，PBS冲洗2分钟×3次。应用二氨基联苯胺(DAB)溶液显色，3～10分钟内在显微镜下观察，观察到细胞核/浆/膜产生棕色颗粒为阳性细胞。自来水洗去染液终止反应，蒸馏水冲洗、苏木素复染、脱水、透明，中性树胶封片。
5 统计学分析
每组标本在显微镜下随机观察8个视野，计数单位面积(mm2)内的阳性细胞数，计数结果用均数±标准差表示。所有数据采用SPSS13.0处理，组间分析采用t检验。
结 果
1 诱导MSCs转分化为汗腺样细胞
培养的MSCs 呈梭形，细胞散在分布，培养7天细胞生长形成克隆状并以克隆为中心快速向外扩散生长。汗腺细胞培养1～2天贴壁生长，细胞呈多边形从汗腺长出，细胞之间连接紧密，形成围绕汗腺的环状单层，一些细胞在原来单层基础上继续生长成为多层，如铺路石样。汗腺细胞经47 ℃处理后，绝大多数细胞仍处于贴壁状态。MSCs加入到汗腺细胞培养后均匀分布在汗腺细胞之上以及汗腺细胞之间。将这些经过诱导的MSCs移植于创面后，其创面愈合过程与参考文献1类似，在此不再赘述。
2 发汗试验
4例移植有经诱导的MSCs的部位发汗试验均为阳性，对照部位均为阴性。移植部位阳性反应呈现散在点状蓝黑色显色区域，对照部位未出现这种显色反应。
3 免疫组织化学染色
正常皮肤、瘢痕组织、移植部位组织和对照部位组织这4组组织均有S?100、 NSE、 Ⅷ?R Ag 和CD34阳性染色细胞。正常皮肤中S?100阳性细胞分布在表皮和真皮层，NSE阳性细胞分布于真皮层。在汗腺分泌部和导管间有较多的S?100和NSE阳性细胞(图1a、b,表1);在瘢痕组织中S?100和NSE的阳性表达，分别分布于表皮层和真皮层(图1c、d,表1);在移植MSCs部位真皮层观察到有聚集的细胞团块，类似汗腺组织，呈不规则三角形团块，但尚未形成管腔，在其中和其周围有较多的S?100 和NSE阳性细胞(图1e、f,表1)，这种情况类似于正常汗腺组织的神经支配和分布模式;而对照部位皮肤组织中也有较多的S?100和NSE阳性细胞，但没有这种类似于汗腺细胞的聚集分布(图1g、h,表1)。
在正常皮肤中Ⅷ?R Ag 和CD34阳性细胞分布较一致，均分布在真皮层和汗腺分泌部周围与导管间(图2a、b,表1);瘢痕组织中Ⅷ?R Ag和CD34阳性细胞数目较多，形成血管状;在移植MSCs部位皮肤组织中，有类似汗腺组织的三角形组织团块，在其中及其周围有新生的血管形成(图2c、d,表1)。正常汗腺和这种再生汗腺样组织的周围均有相似且较多的阳性细胞构成的血管(图2e、f,表1);而对照部位皮肤中也有较多的Ⅷ?R Ag 和CD34S阳性细胞，但没有这种聚集细胞分布(图2g、h,表1)。表1 4种组织中神经与血管标志物的免疫组织化学染色结果
与正常皮肤组比较：aP<0.05;与瘢痕组比较：bP<0.05a.正常皮肤s?100 Protein;b.正常皮肤NSE;c.瘢痕组织s?100 Protein;d.瘢痕组织NSE;e.移植部位皮肤s?100 Protein;f.移植部位皮肤NSE;g.对照部位皮肤s?100 Protein;h.对照部位皮肤NSE，Bar:10 μm
讨 论
大面积深度烧伤患者的救治目前已经达到了很高的成活率。但是，患者愈合后的创面因瘢痕形成通常会丧失正常皮肤的许多功能，从而影响患者的生活质量。因此， 如何提高这些幸存者的生活质量，已成为创烧伤工作者所面临的新的挑战，其中汗腺、皮脂腺再生研究已成为重要的课题之一。
人们在研究再生皮肤排汗功能的过程中，认识到干细胞的应用为这一难题的解决提供了新的思路[2]。近年来,以骨髓间充质干细胞为代表的成体干细胞被证实具有向骨、软骨、心肌、血管、脂肪、皮肤、神经等多个胚层细胞分化潜能,并且自身的间充质干细胞具有免疫原性低、易大量获取等特点,因而可以作为新的干细胞来源以弥补原有干细胞数量上不足[3-5]。本工作的前期研究已证实，通过干细胞诱导和移植技术可以在较大程度上促进大面积深度烧伤患者汗腺的修复与再生[1]。人体移植试验表明,在切除瘢痕的创面种植经诱导后具有汗腺细胞表型的MSCs,不仅可以使这些移植的细胞存活,而且这些细胞还能转变为汗腺样组织并发挥排汗功能。形态学观察显示移植部位创面真皮浅层有大量CEA染色阳性细胞,结构类似正常汗腺组织。同时功能学检测也表明再生的汗腺组织所分泌的汗液具有与正常汗液类似的pH值、渗透压和化学成分。这些结果充分说明建立适当的诱导条件，能在体外将MSCs诱导成为汗腺细胞表型样细胞，将这些细胞移植于创面可以参与人体汗腺组织结构和功能的修复和重建。
正常皮肤汗腺组织有丰富的血液供应，并且其排汗活动受到交感神经的支配。因此，研究再生汗腺组织的神经和血管支配特征，并与正常皮肤的汗腺组织进行比较，对于进一步认识再生汗腺的排汗机制与再生汗腺组织的质量有重要意义。
S?100广泛存在于间叶源性细胞和淋巴造血组织，如胶质细胞、软骨细胞、雪旺氏细胞和朗罕氏细胞等。NSE是一种胞浆内蛋白，主要表达于神经细胞、某些神经内分泌细胞及神经内分泌肿瘤细胞等。因此，这两种抗体常用于检测神经在组织中的分布与支配情况。Ⅷ?R Ag为血浆中的一种糖蛋白，存在于人的血管内皮细胞、巨核细胞和血小板。而CD34是一种分子量为105～120KD的单链穿膜蛋白，表达于早期淋巴造血干细胞、祖细胞、血管内皮细胞、胚胎纤维母细胞和某些神经组织的细胞。这两种抗体现多用于标记血管内皮细胞，显示组织内的血管分布。
本研究中S?100、NSE、Ⅷ?R Ag 和CD34的检测结果显示，尽管4组组织中4种标志的阳性细胞的分布和数量不同，但其共性是4种组织均受到神经的支配和血液的供应。如将4组组织的阳性细胞数进行组间t检验，又显示正常皮肤与瘢痕组织、移植部位皮肤和对照部位皮肤4种抗原表达之间均有显著性差异(P<0.05)。S?100结果显示移植部位皮肤和对照部位皮肤都与瘢痕组织之间有差异(P<0.05)，而NSE、Ⅷ?R Ag 和CD34的检测结果显示瘢痕组织与移植部位皮肤、对照部位皮肤三者之间无显著性差异。这些结果提示移植部位皮肤、对照部位皮肤的神经血管的再生与分布出现了新的变化，神经和血管均多于正常皮肤。但瘢痕组织、移植部位皮肤和对照部位皮肤之间的血管分布无明显变化。只有S?100在这4组组织中的分布与其它3项指标不一致，S?100在瘢痕中表达最少，正常皮肤中次之，移植部位皮肤和对照部位皮肤均有较多的增加。
将正常皮肤组织的汗腺与诱导MSCs再生汗腺组织进行比较，观察到两种汗腺组织的周围均有较多的S?100 阳性表达，提示在移植部位皮肤中再生的汗腺周围有较多新生神经的支配，这与正常汗腺的神经支配是相似的。
本文报道了将诱导的MSCs在体内移植后在再生汗腺及其周围组织中的神经与血管分布特征，结果显示移植的MSCs在术后3个月仍然存活，形成类似汗腺的组织团块，在其周围和内部有新生的神经和血管，提示再生汗腺组织受到了新生周围神经的支配和新生血管的血液供应。有关干细胞移植的研究表明，移植的干细胞可以分化为具有所在组织表型和功能的细胞，但是尚未阐明在体移植后是否受到再生血管神经的支配。根据本研究结果，我们可以得出这样的结论，即移植的干细胞在再生汗腺的过程中受到了再生血管神经的支配。
本研究虽然检测到了再生汗腺组织具有神经与血管的支配,但是作者认为研究汗腺组织再生，还应该进一步做某些与正常汗腺的对比研究，如再生汗腺的神经支配与排汗机制等相关研究正在进行中。
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