唑来膦酸联合甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞生长及化疗敏感性研究

             作者：龚海洋，蔡郑东，郑龙坡，李国东，华莹奇

【摘要】  ［目的］ 本试验主要观察第3代二膦酸盐类药物唑来膦酸（zoledronic acid，ZOL）在体外对人骨肉瘤细胞株MG63生长的影响，进一步研究唑来膦酸与甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）合用对MG63细胞的生长抑制是否具有协同作用。［方法］ 采用MTT法分别检测不同剂量的唑来膦酸、甲氨蝶呤对人骨肉瘤细胞株MG63生长作用，检测唑来膦酸联合甲氨蝶呤对人骨肉瘤细胞株MG63的增殖抑制。［结果］唑来膦酸对MG63细胞的抑制效应与药物剂量及作用时间均成正比。单药唑来膦酸组剂量为1、10 μmol/L时，MG63细胞凋亡率分别为9.91%、48.95%，单用甲氨蝶呤（1、10、100 mg／L）时细胞凋亡率为37.68%、45.93%、52.418%，当唑来膦酸(10 μmol/L)联合甲氨蝶呤（1、10、100 mg／L）时MG63细胞的凋亡率分别为51.96%、66.77%、69.23%，联合用药组与单药组相比差异有显著性(P<0.01)。唑来膦酸作用MG63细胞72 h的IC50值为9.39 μmol/L。［结论］唑来膦酸对人骨肉瘤细胞株MG63有生长抑制作用，呈时间、剂量依赖性效应，唑来膦酸与甲氨蝶呤有协同作用。

【关键词】  骨肉瘤； MG63细胞系； 唑来膦酸； 甲氨蝶呤； 协同作用

    Abstract: ［Objective］To explore the possible interest of therapeutic approaches including nitrogen-containing biphosphonate zoledronic acid using osteosarcoma cell lines MG63，and to investigate whether there is a synergism between zoledronic acid and methotrexate. ［Method］Zoledronic acid alone or combined with methotrexate was used to treat human ostoesarcoma cells line MG63.The cell growth inhibition was assessed by MTT.［Result］There was a dose-dependent and time-dependent (1-100μmol／L) inhibition of cell proliferation by zoledronic acid.IC50 value of zoledronic acid for therapy of MG63 after 72h was 9.39 μmol/L.The cell growth inhibition rates of MG63 at 72 h was 48.95% in zoledronic acid (10 μmol/L) group，and 37.68%,45.93% and 52.42% in methotrexate groups MTX（1,10 and 100 mg／L）.When combined treatment of zoledronic acid (10μmol/L) and methotrexate（1,10 and 100 mg／L）was used，the cell growth inhibition rates were 51.96%,66.77% and 69.23%,respectively. The combination of zoledronic acid and methotrexate demonstrated a synergistic effect. The differences were significant(P<0.01).［Conclusion］Zoledronic acid has an explicit effect of inhibiting proliferation of MG-63 cells in a time-and dose-dependent manner.Its IC50 value is 9.39 μmol/L. Zoledronic acid could induce apoptosis and has a synergistic interaction with methotrexate.

    Key  words：ostoeosarcoma；  MG63；  zoledronic acid；  methotrexate；  synergistic effect

    骨肉瘤是一种好发于青少年的恶性肿瘤，有效化疗应用以前，即使采取较为彻底的截肢术，其治愈率也从未超过20%。自从70年代实施化疗以及新辅助化疗的应用以来，骨肉瘤的预后有了显著的改善，5年生存率也相应提高到50%～80%。然而，骨肉瘤的远未达到完善的程度。目前在化疗方面仍存在的争议问题是：最理想的药物组合、给药时机、给药顺序和途径以及治疗的时间。

    二膦酸盐是近年来研发的抗代谢性骨病的一类新药，主要用于治疗骨质疏松症、恶性肿瘤引起的高钙血症、骨痛症等。除具有强大的抑制骨吸收功能外，二膦酸盐的抗肿瘤作用也受到越来越多的重视。最近的研究表明：二膦酸盐对于骨肉瘤细胞有抗肿瘤作用。为探索骨肉瘤化疗的新方法，本试验观察了唑来膦酸(ZOL)对骨肉瘤MG63细胞系生长的影响，并联合骨肉瘤经典化疗药物甲氨蝶呤（MTX），观察唑来膦酸与甲氨蝶呤的协同作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    人骨肉瘤细胞株MG63购自院。试剂：唑来膦酸、甲氨蝶呤为购自济南日月化工有限公司的高纯度原料药；DMEM、胎牛血清购自美国Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司；ELX800酶标仪(BIO-Tekinstruments，美国)。

    1.2  方法

    1.2.1  唑来膦酸、甲氨蝶呤配制

    1 mol/L的唑来膦酸母液滤过0.22 μm的过滤器，用DMEM培养基将唑来膦酸滤过液稀释成1 μmol／L、5 μmol／L、10 μmol／L、20 μmol／L、50 μmol／L、100 μmol／L。1 g/L的甲氨蝶呤母液滤过0.22 μm的过滤器，用DMEM培养基将滤过液稀释成1 mg／L、5 mg／L、10 mg／L、20 mg／L、50 mg／L、100 mg／L。

    1.2.2  细胞培养

    MG63细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5%CO2、饱和湿度37℃培养箱中培养。细胞贴壁生长，0.125%的胰蛋白酶消化传代，1～3 d换液1次。

    1.2.3  MTT比色法

    取对数生长期的MG63细胞按1×104／孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl，24 h后换液。设空白对照组(不接种细胞，只加培养液)、对照组(接种细胞，不加化疗药物)及实验组(唑来膦酸、甲氨蝶呤单药组及联合用药组加不同浓度的干预药物)，每组设3个复孔。分别继续培养48 h、72 h、96 h后加入MTT试剂(5 g/L)20 μl，空白对照组加入20 μlPBS，继续培养4 h后吸出上清，每孔加DMSO 150 μl，置水平摇床上摇10 min后，在酶联免疫测定仪上选择波长540 nm，空白对照孔调零，测定各孔吸光度A。细胞生长的抑制率。抑制率=(1-实验组A平均值／对照组A平均值)×100%。根据直线回归法计算唑来膦酸作用于MG63细胞的IC50值。

    1.2.4  统计学方法

    用SPSS 12.0进行处理.用卡方检验来验证显著性，P<0.01为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  唑来膦酸对人骨肉瘤MG63细胞系生长的抑制作用

    正常人骨肉瘤MG63细胞系呈梭形或类圆形，贴壁生长。生长力旺盛。唑来膦酸(1、10 μmol／L)处理72 h的MG63细胞梭形不明显，有些细胞变得细长，有些细胞变得圆钝；唑来膦酸20 μmol/L处理的MG63细胞梭形消失。细胞核变小变形，胞浆明显变少；唑来膦酸100 μmol／L以上处理的MG63细胞细胞核变小、浓缩，细胞呈圆形，绝大部分细胞呈坏死状。不同浓度的唑来膦酸对MG63细胞的抑制作用呈时间依赖性及剂量依赖性。唑来膦酸浓度从1 μmol／L上升到100 μmol/L时，随着唑来膦酸浓度的升高，细胞存活率明显降低。唑来膦酸对MG63细胞作用72 h的IC50值为9.39 μmol/L，IC25值为2.85 μmol/L，IC75值为30.96 μmol/L。见图1。

    图1ZOL干预MG63细胞体外生长抑制曲线。将1 mol/L的MTX母液配置成不同终浓度并分别处理MG63细胞，于加药后48 h，72 h，96 h检测细胞抑制率

    2.2  甲氨蝶呤对人骨肉瘤MG63细胞系生长的抑制作用（见图2）。

    图2MTX干预MG63细胞体外生长抑制曲线。将1 g/L的MTX母液配置成不同终浓度并分别处理MG63细胞，于加药后48 h，72 h，96 h检测细胞抑制率

    2.3  唑来膦酸与甲氨蝶呤的协同作用（见图3）。

    图3ZOL联合MTX干预MG63细胞体外生长抑制曲线。将10 μmol／L ZOL分别加入1～100 mg/L不同浓度的MTX并作用于细胞，于加药后48 h，72 h，96 h检测细胞抑制率

    以不同浓度的甲氨蝶呤（1～100 mg/L）处理细胞，在另一组甲氨蝶呤中每孔加入10 μmol／L唑来膦酸联合应用。分别于加药后48 h，72 h，96 h观察结果。发现单用甲氨蝶呤对于骨肉瘤MG63细胞有抑制作用并呈剂量-时间依赖性。其IC50值为50.99 mg/L。唑来膦酸单药ZOL组剂量为1 μmol/L、10 μmol/L时，MG63细胞凋亡率分别为9.91%、48.95%，单用MTX（1、10、100 mg／L）时细胞凋亡率为37.68%、45.93%、52.418%，当唑来膦酸(10 μmol/L)联合MTX（1、10、100 mg／L）时.MG63细胞的凋亡率分别为51.96%、66.77%、69.23%。经卡方检验，联合用药组的凋亡率高于单药组。x2=8.83(P<0.05，见表1)。

    表1  ZOL联合MTX对MG63细胞的生长抑制作用（72 h）组    别生长抑制率（%）MTX 1mg／L37.68MTX 10mg／L45.93MTX 100mg／L52.42ZOL 10μmol/L48.95MTX 1 mg／L+ ZOL 10μmol/L51.96MTX 10mg／L+ ZOL 10μmol/L66.77MTX 100mg／L+ ZOL 10μmol/L69.23

    3  讨论

    肿瘤细胞对现有抗癌药物产生耐药性、药物的毒性反应是目前肿瘤化疗失败的主要原因。目前临床上关注的问题是：最理想的药物组合、给药时机、给药顺序和途径以及的时间。

    二膦酸盐是近年来研发的抗代谢性骨病的一类新药，主要用于治疗骨质疏松症、恶性肿瘤引起的高钙血症、骨痛症等。除具有强大的抗骨吸收功能外，二膦酸盐的抗肿瘤作用也受到越来越多的重视。其抗肿瘤作用主要表现在3个方面：（1）抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡；（2）抑制肿瘤细胞粘附、迁移和侵袭；（3）与放、化疗的协同作用。有研究证实，唑来膦酸对于乳腺癌［1］、前列腺癌［2］、肺腺癌［3］等均有抗肿瘤作用。最近的研究表明二磷酸盐对于骨肉瘤细胞有抗肿瘤作用。唑来磷酸作用于骨肉瘤细胞周期与生长调控的ATM/Chk1/cdc25路径［4］并造成DNA损伤，S期细胞堆积［5、13］。唑来磷酸还可以增强gammadelta T淋巴细胞对骨肉瘤细胞的杀伤作用［6］。Dass CR等［7］用老鼠试验证实骨肉瘤细胞不仅能够抑制肿瘤生长、减少肺转移［8］、减少骨质溶解，还能减少病骨中破骨细胞的数量和肿瘤血管的密度，提示唑来膦酸对于骨肉瘤细胞的生存能力、侵袭性、分化及血管再生能力均有影响。唑来膦酸还可抑制骨肉瘤LM8细胞的体外黏附，迁移和侵袭。［9］

    与放疗的协同作用方面，有研究证实唑来磷酸和阿霉素、紫杉醇、双氟胞苷合用具有协同效果［10］，增强顺铂对骨肉瘤细胞的细胞毒作用［11］。骨肉瘤动物模型组织学研究显示唑来膦酸和异环磷酰胺合用可诱导肿瘤移植部位的广泛纤维化，表明两药联用可明显促进组织的修复并明显降低骨肉瘤的复发。［12］

    本次实验采用MTT法证实了唑来膦酸对骨肉瘤MG63细胞增殖有抑制作用，且这种抑制效应与药物浓度、作用时间呈正相关性。将MTX与小剂量化疗药物唑来膦酸联合应用后观察到对MG63细胞的生长抑制效应明显强于唑来膦酸或MTX单独用药，这说明唑来膦酸能增强骨肉瘤细胞对MTX的化疗敏感性。为两种药物在临床上的应用提供了一定的理论依据。二膦酸盐类药物毒副作用小、无骨髓抑制、患者对其耐受性好故可较大剂量长期使用。在用MTX化疗时，添加唑来膦酸可以减少MTX的用量，增加疗效，有利于减轻化疗的不良反应。不过试验中作者也发现协同作用的大小和药物作用的时间、剂量有关。最佳联合用药的浓度、时间尚需进一步体内试验或临床试验验证。

【】
  ［1］ Woodward JK,Neville-webbe HL, Coleman RE, et al.Combined effects of zoledronic acid and doxorubicin on breast cancer cell invasion in vitro［J］. Anticancer Drugs, 2005,16:845-854.

［2］ Helen L, Neville W, Amin RH,et al.Sequence-and schedule-dependent enhancement of zoledronic acid induced apoptosis by doxorubicin in breast and prostate cancer cells［J］.Int J Cancer，2005，113：364–371.

［3］ 杨振华，束永前，邵茜雯.唑来膦酸对肺腺癌细胞的生长及化疗敏感性研究［J］.南京医科大学学报，2006，26：817-821.

［4］ Iguchi T, Miyakawa Y, Saito K,et al.Zoledronate-induced S phase arrest and apoptosis accompanied by DNA damage and activation of the ATM/Chk1/cdc25 pathway in human osteosarcoma cells［J］.Int J Oncol，2007，31:285-291.

［5］ Kubista B, Trieb K, Sevelda F,et al.Anticancer effects of zoledronic acid against human osteosarcoma cells［J］.J Orthop Res，2006，24:1145-1152.

［6］ Muraro M, Mereuta OM,Carraro F. Osteosarcoma cell line growth inhibition by zoledronate-stimulated effector cells cellular immunology［J］.In Press, Corrected Proof.

［7］ Dass CR, Choong PF. Zoledronic acid inhibits osteosarcoma growth in an orthotopic model［J］. Mol Cancer Ther，2007,6:3263-3270.

［8］ Ory B, Heymann MF, Kamijo A,et al. Zoledronic acid suppresses lung metastases and prolongs overall survival of osteosarcoma-bearing mice［J］. Cancer,2005,104:2522-2529.

［9］ 刘家国,杨述华,何贤峰.唑来膦酸对骨肉瘤LM8细胞黏附迁移和侵袭力的影响［J］.骨肿瘤骨病,2007,6:93-95.

［10］Horie N, Murata H, Kimura S, et al.Combined effects of a third-generation bisphosphonate, zoledronic acid with other anticancer agents against murine osteosarcoma［J］.Br J Cancer，2007, 96:255-261.

［11］Benassi MS, Chiechi A, Ponticelli F,et al.Growth inhibition and sensitization to cisplatin by zoledronic acid in osteosarcoma cells［J］. Cancer Lett，2007,250:194-205.

［12］Heymanna D,Orya B,Blancharda F,et al. Enhanced tumor regression and tissue repair when zoledronic acid is combined with ifosfamide in rat osteosarcoma［J］.Bone,2005,37:74-86.

［13］Ory B,Blanchard F,Couillaud S,et al.Zoledronic acid induces osteosarcoma cell death by aif translocation and cell cycle arrest in S and G2/M phases［J］. Bone, 2006,38:59.

［14］孙刚，李书忠. 氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察［J］.中国矫形外科杂志，2008，16：26-28.