低强度脉冲超声波影响兔骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙复合修复骨缺损的实验研究

             作者：梁伟，苟三怀，欧阳跃平，刘岩，严力生，陈洪勋

【摘要】  ［目的］ 探讨低强度脉冲超声波(LIPUS)影响β-磷酸三钙(β-TCP)与兔骨髓基质干细胞(BMSCs)复合体修复兔桡骨骨缺损的效果。［方法］ 从兔股骨粗隆部抽取骨髓，体外培养扩增，取第3代BMSCs接种于β-TCP培养1周，分为两组，一组予以LIPUS作用，另一组作为对照。以20只成年新西兰兔为研究对象，制作双侧桡骨远端骨缺损模型。一侧桡骨骨缺损处植入LIPUS作用过的细胞支架复合体做为实验组，另一侧植入LIPUS未作用过的细胞支架复合体做为对照组。分别于术后4周、8周处死新西兰兔，运用机图像分析X线片上骨痂的灰度密度，行组织学切片检查骨痂生长情况。［结果］X线片骨痂灰度密度测量提示实验组骨痂较对照组生长明显增多。组织学切片显示实验组血肿机化、吸收、骨小梁和骨基质形成早于对照组。［结论］在骨缺损修复早期，LIPUS对BMSCs与β-TCP复合体修复兔骨缺损有明显的促进作用；而在骨缺损修复晚期，LIPUS的作用相应减弱。

【关键词】  骨组织工程； 细胞支架复合体； 骨缺损； 低强度脉冲超声波

    Abstract: ［Objective］To explore the effect of low intensity pulsed ultrasound(LIPUS) on the ability of repairing rabbit radius defect by cell-scaffold complex composed with bone marrow stromal cells (BMCs) and β-tricalcium phosphate (β-TCP). ［Method］Bone marrow of a rabbit was drawn and cultured by differentiation culture medium to harvest BMCs and the third generation BMCs were cultivated on β-TCP for one week in vitro.Bilateral distal radial defects were made using a 1-mm saw in 20 mature New Zealand white rabbits.The cell-scaffold complexs stimulated by LIPUS were implanted in rabbit radial defects (cell-scaffold complexs without stimulation as control).All the rabbits were killed at 4 or 8 weeks after operation.The defect healing state was observed with X-ray and histological technic.The gray density of CA was analyzed by computer image analysis system.［Result］It was found that the callus in the experimental group grew more quickly and apparently than that in the control group.At 4 weeks after operation,there was significantly statistical difference (P<0.05) in CA hetween the two groups with image analysis system.But at 6 weeks after operation,the bone density difference was not statistically significant (P>0.05).Histological slices in the experimental group showed that the absorption,organization of hematoma,the formation of trabeculae and matrix preceded those in the control group.There were more fibroblast,osteoblasts and callus in the experimental group.［Conclusion］Cell-scaffold complex composed with BMCs and β-TCP stimulated by LIPUS can repair bone defect more effectively than that without LIPUS stimulation at the early stage of healing,but the effect  tend to decrease at the late stage.

    Key  words：bone tissue engineering;  cell-scaffold complex;  bone defect;  low intensity pulsed ultrasound

    骨缺损的是骨科临床医师面临的难题之一，创伤、肿瘤和重建常常导致骨缺损。尽管骨组织有强大的自我修复能力，但是骨缺损的面积较大时，常常导致骨不连和机体功能的丧失。自体骨移植是公认的金标准，它具有骨诱导、骨传导和提供成骨细胞的优点，但移植骨的大小和形状受到限制，而且往往带来供区并发症，限制其应用。

    组织工程骨的出现为克服上述不足提供了新方法：其基本思路是将活细胞体外培养增殖后，与支架材料相复合修复骨缺损。LIPUS作为一种超过人类听阈范围的高频声波，可对骨和周围组织产生微型压力作用，导致细胞生化性能发生改变，从而促进骨折愈合［1、2］。临床上，LIPUS已经被成功用于促进骨折愈合和治疗骨不连。

    既然LIPUS被广泛应用于临床刺激骨增生，而组织工程骨在修复骨缺损方面的应用又备受关注，将这两种治疗方法结合起来治疗骨缺损有可能产生更好的效果。本实验采用经LIPUS刺激的兔BMSCs和β-TCP组成的细胞支架复合体修复兔桡骨骨缺损的方法，为评估LIPUS应用到骨组织工程上的可行性提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    3个月龄成年雄性新西兰大耳白兔，体重(2.3～3.2 kg)，由上海市伤骨科研究所动物实验中心提供。

    DMEM培养液(GIBCO)，10%胎牛血清(杭州四季青公司)。条件培养基：在10%胎牛血清(FBS)低糖DMEM培养基中加入以下试剂(Sigma,USA)：1×10-8 mmol／L地塞米松：（10 mmol／L β-甘油磷酸钠；50 mg／L维生素C）。

    立刻生TM低强度脉冲超声波治疗仪，由杭州核新生物医疗技术有限公司提供。超声波强度为40 mW／cm2，超声波频率为1.5 MHz，脉冲频率为1 kHz，脉冲宽度为200 ms，间隙时间为800 ms。

    1.2  实验方法

    1.2.1  取材及细胞培养  3%戊巴比妥钠按25 mg／kg浓度对新西兰白兔经耳缘静脉给药麻醉后，取10 ml已肝素化处理的注射器抽取股骨粗隆部骨髓约5 ml。无菌工作台上，用200目滤纱过滤骨髓，1 500 r／min水平离心4 min，将沉淀的细胞重悬于含10%胎牛血清(FBS)低糖DMEM培养基的培养瓶中(25 cm2)，置于恒温二氧化碳细胞培养箱中培养(37℃、5%CO2、100%饱和湿度)。第5 d首次进行半量换液，加入DMEM培养液，此后每周换液2次。待培养皿中细胞融合成单层时，采用酶消化法+机械刮除法进行细胞传代：0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞脱壁，将细胞悬液按1∶3的比例接种，继续培养。

    1.2.2  制作BMSCs-TCP复合体  将第3代BMSCs以1×106个/孔的密度接种于4块6孔培养板中，每个孔内均加入10 mm×5 mm×5 mm大小的TCP支架和条件培养基后，其中两块培养板应用LIPUS对BMSCs每天作用20 min，作用时间为1周，另两块培养板作为对照组未予作用。在立刻生TM骨科超声治疗仪的治疗头上涂抹耦合胶，并紧贴在实验组培养板底部进行作用。

    1.2.3  BMSCs-TCP复合体修复兔桡骨骨缺损  采用自身对照的方法，以20只成年雄性新西兰白兔的双侧桡骨为实验材料。前肢从中段到踝关节脱毛，以3%戊巴比妥按25 mg／kg的剂量行耳缘静脉注射麻醉。在无菌条件下，取双前肢外侧切口，沿桡骨纵行切开皮肤，于肌间隙进入，暴露桡骨中下段，切开骨膜，剥离约3 cm长，用厚1 mm的钢锯造成双侧桡骨中段横行皮质缺损约10 mm×5 mm×5 mm大小。实验组(左前肢)用与骨缺损大小基本一致的经LIPUS作用过的BMSCs-TCP复合体修补骨缺损，对照组(右前肢)用未经LIPUS作用过的BMSCs-TCP复合体修补骨缺损。

    1.3  观测指标

    1.3.1  摄片方法及X线片灰度密度分析  分别于术后4周和8周，采用心内注射空气法处死新西兰兔各10只。将所有兔桡骨标本送至上海长征放射科，球管至胶片的距离是0.5 m。摄片条件：50 KV，6 mA，曝光时间为0.8 s，荧光灯下阅片。用扫描仪将X线片图像输入电脑中，选取原骨缺损处骨痂1.0 cm×0.5 cm进行图像分析，平均灰度越大，说明骨痂平均密度越高。本实验中实验组和对照组桡骨在相同条件下由专人负责拍摄，统一处理。

    1.3.2  HE染色标本的制备  以桡骨骨折处为中心，截取2 cm，剔除软组织。将标本置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，以质量浓度比为200 g／L的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙2～3周，脱钙后的标本经彻底冲洗，沿桡骨中轴矢状面剖开，经酒精逐级脱水、透明石蜡包埋，5 μm厚做连续切片，然后进行常规HE染色。常规HE染色可观察骨折端血肿、纤维组织、新生软骨及骨组织等的演变过程。

    1.4  统计学分析

    应用SPSS 10.0软件对实验组和对照组骨痂灰度密度的差异进行t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  骨缺损修复的X线片观察

    术后4周，细胞支架复合体与骨缺损边缘界限清晰，内有类似软组织样物质填充，提示骨缺损处骨痂形成不明显，肉眼观察实验组骨痂较对照组骨痂体积增大(图1)；术后8周，细胞支架复合体与骨缺损边缘界限较为模糊，有连续性骨痂形成，肉眼观察实验组和对照组骨痂形成量亦无明显差异(图2)。

    2.2  X线片灰度密度分析

    术后4周，实验组与对照组相比，标本骨痂灰度密度明显增加，并具有统计学意义。术后8周，实验组与对照组相比，标本骨痂灰度密度无明显差异（表1）。

    表1  实验组与对照组图像分析骨痂灰度密度积分(n=10，x-+s）group4周8周LIPUS86.40±5.8862.33±6.39control124.73±7.63117.90±8.28P<0.05>0.05  图1术后4周实验组与对照组骨痂X线片，图中上面标本为试验组，下面标本为对照组  图2术后8周实验组与对照组骨痂X线片2.3  骨缺损修复的组织学观察

    所有含有β-TCP人工骨的标本中，人工骨植入部位的组织学检查未出现炎症反应和异物组织反应。

    术后4周，实验组标本中，桡骨缺损断端与陶瓷人工骨交界部软骨细胞少见，可见新生骨形成，髓腔内成骨细胞较多，排列在陶瓷骨微孔表面，结构疏松，可见少量的骨陷窝(图3)；而对照组标本中，桡骨缺损断端与陶瓷人工骨交界部可见少量新生骨和纤维骨痂形成，软骨细胞较多(图4)。

    术后8周，实验组标本中，骨缺损陶瓷微孔中大量新生骨充填，空白孔隙区较少，既有类骨质，又有质地均匀、排列整齐的板层骨，中间可见“哈佛氏管”样结构：其中央有血管形成，其内可见大量骨细胞(图5)。而对照组标本中，大量成骨细胞贴附在陶瓷微孔内，未见纤维组织，新生骨和纤维骨痂并存(图6)。图3缺损断端与人工骨交界部软骨细胞少见，髓腔内成骨细胞较多，排列在陶瓷骨微孔表面，结构疏松，可见少量的骨陷窝(术后4周实验组HE ×100)  图4缺损断端与人工骨交界部可见少量新生骨和纤维骨痂形成，软骨细胞较多(术后4周对照组HE×100) 

    图5骨缺损陶瓷微孔中大量新生骨充填，既有类骨质，又有质地均匀、排列整齐的板层骨，中间可见“哈佛氏管”样结构(术后8周实验组HE ×100)  图6陶瓷微孔内可见大量成骨细胞，未见纤维组织，新生骨和纤维骨痂并存(术后8周对照组HE×100)3  讨论

    理想的的骨组织工程支架应该满足以下特点：（1）良好的骨传导性；（2）生物可降解性以及吸收速率的可调性；（3）具备一定的机械强度；（4）易于塑性［3］。TCP结构上与天然骨盐大体一致，有较好的生物相容性和骨结合的能力，可达到较高的强度和耐磨性，且可制成多孔状材料，加上无毒副作用，做为一种骨组织替代材料，被广泛应用于临床［4］。

    目前评估组织工程骨的常用方法是在体外分离、培养种子细胞，将一定数量的种子细胞接种到具有一定空间结构的三维支架上，然后将此细胞—支架复合体植入动物体内，通过细胞之间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织，在生物支架降解过程中，接种的细胞继续繁殖，形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织，达到修复创伤和重建功能的目的。而应用工程化骨组织修复骨缺损无疑在临床工作中最具有实际价值［5、6］。尽管组织工程骨在临床上已经应用几十年，但依然进展缓慢。其中一个重要的原因是其诱导骨生成的效率低，对种子细胞的增殖作用弱，修复骨缺损的能力尚未得到充分利用。

    大量的研究表明LIPUS对成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和间充质干细胞均能发生作用，在骨折愈合过程中可以促进骨再生，增加骨痂面积、加速骨强度的恢复。张超等［7］发现LIPUS能够促进人骨膜细胞向成骨细胞分化。从LIPUS在骨痂形成过程中对细胞的作用效果进行推测，它有可能会对BMSCs和β-TCP形成的细胞支架复合体修复骨缺损的效果产生影响。

    目前在骨缺损修复中研究最多的支架材料是β-磷酸三钙。本实验所使用的生物陶瓷以β-TCP为原料，经1 100℃以上的高温烧结而成多孔生物陶瓷。其气孔率为75%±10%，球形孔径500±150 μm，孔沟通率>99%，力学强度>2 MPa。实验过程中应用Leica Qwin图像分析系统对X线片上骨痂含量进行评估，避免了肉眼阅片的主观性和随意性，可以为检测结果提供精确数值。骨痂灰度密度经统计学分析，术后4周的实验组与对照组相比，标本骨痂灰度密度明显增加，并具有统计学意义，证实了LIPUS能促进细胞支架复合体修复骨缺损过程中骨痂的形成。

    术后4周的实验组与对照组相比，标本骨痂灰度密度明显增加，并具有统计学意义；而术后8周，实验组与对照组相比，标本骨痂灰度密度无明显差异。说明LIPUS对细胞支架复合体的影响主要发生在骨缺损修复早期，而在修复晚期，由于动物自身的修复能力，其作用逐渐被减弱。

    实验结果与Pilla和Yang等人的发现是一致的。Pilla等［8］经过多次实验，出LIPUS作用于炎症期和骨痂形成期，在塑形期并未发生作用。Yang等［9］研究表明；同对照组相比，经LIPUS7 d后标本蛋白聚糖基因明显升高，21 d后蛋白聚糖基因明显降低。同时，他们发现前胶原蛋白-Ⅱ有类似的改变趋势，但幅度不大，而前胶原蛋白-I，β-羧基谷氨酸，碱性磷酸酶，β1-转换生长因子等的基因表达没有明显的变化。在体外培养的软骨细胞经LIPUS作用后，同样可观察到蛋白聚糖基因表达增高。这些研究表明LIPUS主要通过软骨内骨化促进骨折愈合。

    综上所述，LIPUS促进细胞支架复合体修复骨缺损的作用主要发生在骨缺损修复的早期而不是塑形期；随着骨缺损术后时间的延长，未经LIPUS作用的对照组有足够的时间修复骨折，LIPUS促进骨折愈合的作用就相对减弱。本实验对LIPUS组织工程骨修复骨缺损的影响进行了初步探索，希望为进一步进行相关研究，为实现LIPUS应用到骨组织工程领域提供实验基础。

【】
  ［1］ Parvizi J, Wu CC, Lewallen DG,et al. Low-intensity ultrasound stimulates proteoglycan synthesis in rat chondrocytes by increasing aggrecan gene expression［J］. J Orthop Res, 1999,17:488-494.

［2］ 梁伟，苟三怀，刘岩，等.碱性成纤维细胞生长因子在低强度脉冲超声波治疗骨折过程中的表达［J］.矫形外科杂志，2004，12：233-235.

［3］ Hutmacher DW,et al.Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage［J］. Biomaterials,2000,21:2529-2543.

［4］ 刘广鹏，赵莉，刘波，等.新型β-磷酸三钙的制备与成骨能力的实验研究［J］.中华创伤骨科杂志，2006，8：755-759.

［5］ Einhom TA.Clinically applied models of bone regeneration in tissue engneering research［J］. Clin Orthop, 1999,367:59267.

［6］ Karpj M, Dahon PD, Shoichet MS.Scaffold for tissue engineering［J］. Mster Res Soc Bull,2003,28:301-306.

［7］ 张超，梁国穗，张颖恺，等.低强度脉冲超声波刺激对人骨髓基质细胞和骨膜细胞生物学效应的影响［J］.中华物理医学与康复杂志，2005，27：657-660.

［8］ Pilla AA.Low-intensity electromagnetic and mechanical modulation of bone growth and repair:are they equivalent［J］.Orthop Sci，7：420-428.

［9］ Yang KH,Parvizi J,Wang,et al.Exposure to low-intensity ultrasound increases aggrecan gene expression in a rat femur fracture model［J］. Orthop Res，14：802-809.