穴位埋线对拟阿尔茨海默病大鼠海马超微结构和胶质纤维酸性蛋白的影响

【摘要】  目的： 探讨穴位埋线对拟阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease ，AD）大鼠海马CA1区超微结构和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的影响。方法： 采用冈田酸（Okadaic acid，OA）海马CA1区多次微量注射建立拟AD模型大鼠，应用肾腧（双侧）、大椎穴位埋线；用Morris水迷宫实验检测动物的学习记忆能力，电镜观察海马神经元超微结构，免疫组织化学方法观察GFAP的表达。结果： （1） 模型组大鼠平均逃避潜伏期明显延长，第Ⅲ象限活动时间明显缩短及穿越站台次数明显减少，海马CA1区神经元超微结构有典型的凋亡改变，GFAP免疫反应阳性细胞明显增多；（2）穴位埋线组大鼠平均逃避潜伏期明显缩短，第Ⅲ象限活动时间明显延长及穿越站台次数明显增多，海马CA1区神经元凋亡现象改善，GFAP免疫反应阳性细胞明显减少。结论： 穴位埋线可能是通过改善AD模型大鼠海马的超微结构和降低GFAP表达的机制而提高AD大鼠的学习记忆能力。

【关键词】  阿尔茨海默病 穴位埋线疗法 迷宫学习 海马 细胞凋亡 神经胶质原纤维酸性蛋白

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease ，AD）是老年人常见的神经系统退行性疾病，以进行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现。AD的主要病理特征为老年斑（senile plaques，SP）、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）以及区域性神经细胞丢失。目前对于AD的病因病机及治疗方法仍无重要突破。针灸对AD的防治有确切的疗效 ，而穴位埋线对AD的治疗及有关机理方面的研究少见报导。本实验采用冈田酸（Okadaic  acid，OA）海马微量注射建立拟AD大鼠，观察肾腧及大椎穴位埋线对拟AD大鼠学习记忆的影响，并通过观察海马神经元超微结构及胶质纤维酸蛋白(GFAP)的表达，探讨穴位埋线影响学习记忆能力的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  SD健康雄性大鼠45只，3～5月龄、体重(280±20)g，由贵阳医学院动物中心 [合格证号SCXK（黔）2002-0001] 提供，条件下饲养，自由饮食。

    1.2  试剂和仪器  Okadaic acid（OA）（美国Sigma公司），临用前溶解于10%二甲亚砜（DMSO）中，配制成浓度为0.4 mmol/L的溶液;抗GFAP多克隆抗体（基因公司）。研究用生物显微镜（德国Leica），日立－600型透射电镜（日本日立），Morris水迷宫。

    1.3  分组及复制拟AD模型  大鼠随机分为3组：对照组，拟AD模型组（简称模型组），肾腧（双）及大椎穴位埋线组（简称埋线组），每组15只。所有大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/100 g）后，固定于大鼠脑立体定位仪上。参照大鼠脑立体定位图谱，将自行设计的十字形套管插入海马CA1区（前囟后3.6 mm，中线右侧旁开2.4 mm，深度2.7 mm），通过套管将OA溶液0.5 μl注入海马CA1区，隔天注射1次，共5次；对照组用同样方法注入等体积的对照液10% DMSO。

    1.4  肾腧、大椎穴位埋线  埋线组大鼠于拟AD模型制作同时,常规消毒后在双侧肾腧穴和大椎穴，用8号针头埋入4/0号5 mm羊肠线，每7 d 1次。

    1.5  大鼠行为学检测  实验于海马CA1区首次注射后的第4周开始。第1～6天进行定向航行试验，记录60 s内大鼠从入水中到爬上站台所需时间即逃避潜伏期。第7天进行空间探索试验，记录120 s内大鼠在第Ⅲ象限的游泳时间和穿越站台次数。

    1.6  灌注取材  水迷宫试验结束后，各组取5只大鼠海马CA1区组织，用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，环氧树脂包埋，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察海马CA1区神经元的结构。各组剩余大鼠经10 %水合氯醛麻醉后，生理盐水和10%中性甲醛灌注，断头取脑，置10%中性甲醛中浸泡固定。取海马注射点前后约3 mm厚标本，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后行大鼠海马冠状位切片，片厚4 μm。

    1.7  免疫组织化学两步法  切片脱蜡至水化， 3%H2O2孵育以灭活内源性过氧化物酶。切片浸入0.01 mol/L的TBS溶液（pH6.0）中，微波热修复。滴加抗GFAP多克隆抗体， 37 ℃水浴箱孵育。滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，使用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗，复染，脱水，封片。

    1.8  显微镜观察  采用Leica摄像显微镜观察并照像。计数每张切片4个随机高倍视野中GFAP阳性细胞数，取平均值作为计数结果，每组10张切片计数，取平均值作为最后结果。

    1.9  统计学处理  应用SPSS 11.5统计分析软件包，进行单因素方差分析，组间比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。统计结果以（x±s）表示。

    2  结果

    2.1  大鼠行为学检测  定向航行实验结果见表1。从第1天开始，模型组与对照组比较，平均逃避潜伏期均明显延长（P<0.01）；埋线组与模型组比较，平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.01）。各组大鼠空间探索试验结果见表2。模型组与对照组比较，第Ⅲ象限活动时间明显缩短（P<0.01），穿越站台次数明显减少（P<0.01）；埋线组与模型组比较，第Ⅲ象限活动时间明显延长（P<0.01），穿越站台次数明显增多（P<0.05）。

    2.2  海马CA1区神经元  对照组细胞核形态规则，圆形，染色质细小、均匀分布，细胞器丰富、结构清晰可见；模型组细胞核形态异常，染色质颗粒化、分布不均、凝集成块，边集在核膜内侧,形成新月体形，细胞器破坏，整个细胞密度明显增加；埋线组细胞核形态欠规则，染色质轻度凝集和边集，细胞器较丰富。表1  各实验组大鼠定向航行实验平均逃避潜伏期表2  各实验组大鼠第Ⅲ象限活动时间和穿站台次数注：（1）与对照组比较，P<0.01；（2）与模型组比较，P<0.05。

    2.3  GFAP的表达  GFAP阳性细胞胞质和突起染成棕黄色颗粒。对照组大鼠海马CA1区GFAP表达较少，胞体小，突起细，染色淡(图1A)；模型组与对照组相比GFAP表达明显增多，胞体变大，突起变粗，染色深(图1B)。埋线组与模型组相比，GFAP的表达明显减少（图1C）。

　　3  讨论

    中医认为AD病变在脑，病本在肾。肾主智， A：对照组,B：模型组,C：埋线组藏精，精生髓而通于脑；脑髓依赖肾精的化生，肾精亏损，脑髓失养，渐致痴呆。足太阳膀胱经下行联络于肾，上行进入颅内联系于脑。“肾腧”穴属膀胱经，刺激该穴可达到“肾充则脑髓实也”的作用。督脉上额交巅上，入络脑。大椎为督脉要穴，又为诸阳之会，刺激本穴能振奋阳气，调节全身脏腑功能，从而起到健脑益髓的作用。穴位埋线是一种融多种疗法、多种效应于一体的复合性方法。羊肠线作为异体蛋白埋入穴位后，以线代针，对机体产生长久的刺激，延长针刺效应时间，增加腧穴功能。同针灸相比，穴位埋线可以减轻机体疼痛应激反应及减少治疗次数而不影响疗效。本研究结果显示穴位埋线的拟AD模型大鼠，学习记忆能明显力改善，为中医穴位埋线治疗AD提供了有利的佐证。

    神经元丢失是AD的主要病理特征,细胞凋亡在AD神经元丢失中起重要作用。细胞凋亡(apoptosis)是细胞基因控制的一种主动死亡过程，在培养细胞、动物模型以及AD病人的尸解中，均发现细胞凋亡的证据[1，2]。本研究的形态学结果显示模型组大鼠海马神经细胞出现染色质颗粒化及边集，都是细胞凋亡的典型表现，说明细胞凋亡参与了AD中枢神经系统损害的病理过程，进而引起神经细胞丢失，影响了模型组大鼠学习记忆能力。埋线组大鼠海马神经元超微结构明显改善，提示穴位埋线可能通过改善海马神经元的功能和形态，减少神经元的凋亡来保护海马细胞，从而改善学习记忆功能。

    星形胶质细胞是脑内数量最多的一种胶质细胞，GFAP是星形胶质细胞的特征性蛋白。中枢神经系统受损伤时，星形胶质细胞转化为反应性星形细胞，表现为星形细胞的肥大和增生[3，4]，以GFAP增多为特征性标志。研究表明，星形胶质细胞增生可能是AD发病的早期因素。目前认为，AD脑中星形胶质细胞增生肥大对神经元有双向作用，一方面，合成和释放神经生长因子，支持神经细胞的存活和轴突生长，并在Aβ的清除及降解、在神经元提供营养支持等方面起重要作用；另一方面，产生大量一氧化氮（NO）、胶质性磷酯酶A2、巨噬细胞炎性蛋白等因子，产生细胞毒作用，加重神经损伤。在星形胶质细胞急剧增生时，损害作用占优势[5～8]。本研究中，埋线组大鼠海马GFAP的阳性表达明显减少。提示刺激肾腧和大椎穴能减少星形胶质细胞的活化与增生，降低GFAP的表达，从而减弱拟AD模型大鼠神经元的损害程度，使学习记忆得到恢复。

【】
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