阿魏酸钠抑制高糖诱导系膜细胞表达PAI-1和p38MAPK

                          作者：桂华珍 罗华 石明隽 肖瑛 郭兵 张国忠 

【摘要】  目的： 观察阿魏酸钠（SF）对高糖诱导系膜细胞（GMC）表达PAI-1蛋白和细胞信号转导分子p38MAPK的影响。方法： 原代培养大鼠肾小球系膜细胞，分为正常组、甘露醇组、高糖组、高糖加不同浓度SF组，分别于处理后24 h、48 h收集细胞。用免疫细胞化学检测各组细胞p38MAPK的表达，流式细胞术检测PAI-1蛋白。结果： 48 h内，高糖促进PAI-1和p38MAPK蛋白的表达，而SF能明显抑制高糖的这种作用，其作用随SF浓度的增加和作用时间的延长而加强。结论： SF能拮抗髙糖诱导的GMC表达PAI-1增多和抑制p38MAPK信号通路。

【关键词】  糖尿病肾病； 葡萄糖； 有丝分裂素激活蛋白激酶类； 纤溶酶原激活物抑制物1； 系膜细胞； 阿魏酸钠

    ［Abstract］ Objective: To observe the influence of sodium ferulate (SF) on PAI-1 and p38MAPK protein expression of mesangial cells in incubation medium with high glucose. Methods: The primarily cultured glomerular mesangial cells (GMCs) were divided into normal glucose group, mannitol group, high glucose group and high glucose plus SF groups of which cells exposed to different concentrations of SF. Cells were collected in 24 h and 48 h after being treated with corresponding agents respectively. The expression of PAI-1 was detected with flow-cytometry and that of p38MAPK protein was detected with immunocytochemistry methods. Results: High glucose significantly promoted the expression of PAI-1 and p38MAPK of GMCs when cultured for 24 h and 48 h. SF inhibited these promotion of PAI-1 and p38MAPK protein induced by high glucose, and the inhibitory effect increased along with the increase of SF concentration and the extension of its affecting time. Conclusion: SF can inhibit the increase of PAI-1 protein and the activation of p38MAPK signal pathway of GMCs induced by high glucose .

    ［Key words］ diabetic nephropathies; glucose; mitagen-activated protein kinases; plasminogen activator inhibitor 1; mesangial cell; sodium ferulate

    糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发病机制十分复杂，至今尚未完全阐明，目前认为显著的高血糖引起的肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）分泌细胞外基质（ECM）成分增多在早期肾小球肥大和晚期肾小球硬化的病理改变中起关键作用[1]。ECM在肾小球沉积受纤溶酶等蛋白分解酶类和其抑制物的共同作用，纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）可以抑制ECM降解而促进其沉积[2]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是重要的细胞内信号转导物，已有研究表明可能介导DN的发病，其中 p38MAPK在DN发病机制中起重要作用[3，4]。阿魏酸钠(sodium ferulate, SF)是一种内皮素拮抗剂，具有广泛的药理作用，已有作者用其糖尿病肾病取得良好效果，然而其作用机理尚未完全阐明[5]。2006年4月~2007年12月用原代培养GMC，观察高糖培养环境中GMC表达PAI-1和p38MAPK蛋白的变化以及阿魏酸钠对其影响，为进一步了解SF治疗DN的作用机制提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂  阿魏酸钠（吉林西点药业科技股份有限公司）；甘露醇（石家庄制药有限公司）；MEM培养基（美国Gibco公司）；L-谷氨酰胺、4-甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶（美国Sigma公司）；胎牛血清(FCS，Hyclone公司)；抗PAI-1抗体、抗p38MAPK抗体、SABC试剂盒（武汉博士德）。

    1.1.2  主要仪器设备  CO2孵箱（美国REVCO）；倒置显微镜(OLYMPUS)；流式细胞仪（美国BD公司）； CM-2000B型生物医学图像分析系统(北京)。

    1.2  方法

    1.2.1  大鼠原代肾小球系膜细胞培养  大鼠双肾灌洗后，分级筛网滤过分离肾小球，用Ⅳ型胶原酶消化处理，种植法体外培养。培养细胞按已建立的方法鉴定，确定为系膜细胞，取第3~4代细胞供实验用[6]。

    1.2.2  实验分组  正常组（5.5 mmol/L D-葡萄糖）；SF加正常糖培养组（SF240 mg/L加5.5 mmol/L D-葡萄糖）；甘露醇组（5.5 mmol/L D-葡萄糖加24.5 mmol/L甘露醇组)；高糖组（30 mmol/L D-葡萄糖）；SF加高糖培养组（SF60、120、240 mg/L加30 mmol/L D-葡萄糖）。各组分别于培养24 h和48 h时收集细胞用于检测。

    1.2.3  用台盼蓝染色，检测存活细胞比例。

    1.2.4  免疫细胞化学法检测p38MAPK蛋白表达  预先在12孔板中加入无菌玻片，向每孔中加入1 ml细胞数为1×105/m1的GMC，细胞周期同步后，药物作用24 h和48 h，收集爬片细胞，95%乙醇固定，山羊血清封闭，滴加1抗体 (1∶50)于细胞爬片，4 ℃孵育过夜，再加生物素化二抗，DAB显色，生物医学图像分析系统分析图像, 得出阳性积分光密度A值。

    1.2.5  流式细胞仪测定PAI-1的表达水平  调整GMC数为5×105个/ml，接种于50 ml培养瓶中，分组培养，分别于24 h和48 h收集细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤2次，用PBS调节细胞数为1×106个/ml，分装于EP管中(1 ml/管)，无水乙醇固定。加入0.5 ml 0.1% Triton X-100，每组12管细胞随机分为6管阴性对照，6管实验组，实验组加入50 μl PAI-1抗体，对照组加入50 μl生理盐水代替一抗，37 ℃震荡水浴20 min，洗掉未结合的抗体，加入50 μl FITC标记的二抗（1∶40），流式细胞仪测1×104个以上细胞的PAI-1，MCYCLE软件分析细胞的荧光强度，以平均荧光强度（MFI）表示蛋白的表达量。

    1.2.6  统计方法  全部数据采用SPSS10.0统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，检验水准以P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  阿魏酸钠对GMC存活的影响 

    　　 SF 3个剂量组的GMC经台盼蓝染色，活细胞数在96%以上，表明所用剂量范围的SF对GMC无明显毒性。

    2.2  高糖对GMC表达p38MAPK和PAI-1蛋白的影响

    　免疫细胞化学显示，正常组和甘露醇组GMC胞浆可见p38MAPK蛋白表达，胞核偶见表达；高糖培养24 h和48 h，GMC胞浆p38MAPK表达显著增多，并且可见较多p38MAPK在细胞核阳性表达。流式细胞术结果表明，正常组和甘露醇组GMC有PAI-1蛋白表达；高糖培养24 h和48 h，GMC表达PAI-1蛋白的荧光强度显著增高。各组p38MAPK和PAI-1蛋白的表达程度见表1。在髙糖培养24 h和48 h 2个时间点，GMC表达的p38MAPK与PAI-1蛋白之间呈显著正相关，相关系数分别为0.925和0.907，均P﹤0.01。

    2.3  不同浓度阿魏酸钠对髙糖诱导GMC表达p38MAPK和PAI-1蛋白的影响

    　　免疫细胞化学显示，SF60 mg/L髙糖组培养24 h，与同时点髙糖组相比，GMC胞浆p38MAPK蛋白的表达比同时点的高糖组显著减少，同时p38MAPK在细胞核内的阳性表达亦减少（图1）。流式细胞术结果表明，SF60 mg/L髙糖组培养24 h，与同时点髙糖组相比，GMC表达PAI-1的荧光强度已明显减少。随SF浓度增加，p38MAPK和PAI-1蛋白的表达减少更显著，浓度为240 mg/L 的SF与60 mg/L相比，差异有显著性；而浓度为120 mg/L与60 mg/L相比，只有24 h时点p38MAPK的表达差异有显著性。相同浓度SF作用48 h，p38MAPK和PAI-1蛋白的表达似比作用24 h减少，但无统计学意义。见表1。表1  高糖和阿魏酸钠对肾小球系膜细胞表达p38MAPK和PAI-1蛋白的影响 (1)与相同时间正常组比较，P<0.01 ； (2)与相同处理时间高糖组比较，P<0.01；(3)与相同处理时间阿魏酸钠(SF)60 mg/L组比较，P<0.05

    3  讨论

    　　糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化而为终末期肾病。髙血糖刺激系膜细胞生物学行为改变，使ECM在肾小球过度沉积，使肾小球肥大乃至硬化[2]。过去的研究表明，链尿菌素性糖尿病大鼠，肾小球系膜细胞发生表型转变而表达α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA），使纤维连接蛋白等ECM在系膜区沉积[7]；ECM过度沉积可能为其生成增多和分解减少所致。有研究表明，高浓度葡萄糖环境培养的GMC组织纤溶酶原激活物（tPA）生成减少，而其抑制物PAI-1增多，从而抑制了ECM降解，尤其是PAI-1起重要作用，通过抑制纤溶酶生成而明显减少ECM的分解[8]。研究表明，正常浓度葡萄糖和高浓度甘露醇培养的大鼠原代GMC只表达少量PAI-1，而高浓度葡萄糖可使GMC表达PAI-1显著增多，提示了髙糖能促进GMC表达PAI-1蛋白，与其他作者的结果一致[8]。

    　　p38MAPK是MAPK家族成员，作为信号分子参与细胞的多种生理、病理过程。研究表明，高浓度葡萄糖可显著增多GMC胞浆和胞核p38MAPK蛋白表达，提示髙糖可使GMC生成p38MAPK蛋白并促进其磷酸化而转移入细胞核，调节DNA的转录，与其他作者报道一致[4]。有研究表明，氧化型HDL3可以经p38MAPK信号通路促进内皮细胞表达PAI-1[9]；并且本研究发现髙糖培养的GMC表达PAI-1和p38MAPK呈显著正相关，因此推测，髙糖可能通过增加p38MAPK的生成和活化，从而促进GMC表达PAI-1。

    　　SF是从当归、川芎等中药提取的成分，具有广泛的药理作用，并发现可以改善糖尿病肾病[5]。但其是否还通过拮抗内皮素以外的机制起作用，目前报道甚少。本研究表明，60 mg/L浓度的SF作用24 h即可以抑制髙糖诱导GMC高表达PAI-1和 p38MAPK，并且随其浓度增加和作用时间延长而作用加强， SF可能通过直接拮抗高糖诱导的GMC表达PAI-1蛋白生成增多或通过抑制高糖诱导产生并激活的p38MAPK信号分子而调节GMC表达PAI-1蛋白减少。

    　　总之，本研究提示SF抑制髙糖诱导GMC表达PAI-1和p38MAPK增多，可能是其改善糖尿病肾病的部分作用机制。

【】
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