麦芽醇对大鼠脑缺血?再灌注后胶质增生的影响甘云波

【摘要】  目的 通过麦芽醇对脑缺血?再灌注后星形胶质细胞增殖进行干预，以探讨其对胶质增生的影响。方法 建立大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）再灌流模型，应用免疫印迹和免疫组织化学方法检测7天后损伤侧海马胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，观察麦芽醇对胶质增生的影响。结果 MCAO后7天，损伤侧海马GFAP的表达明显增强（P<0.01），给予麦芽醇后，可抑制GFAP蛋白的表达（P<0.01）以及星形胶质细胞的增殖。结论 麦芽醇可部分抑制胶质增生，从而有可能为神经再生和功能重建提供更有利的生存环境。

【关键词】  麦芽醇 星形胶质细胞 胶质增生 脑缺血

    ABSTRACT：Objective To investigate the effects of maltol on astrocyte proliferation in hippocampus after focal cerebral ischemia reperfusion in rats. Methods 　The model of ischemia reperfusion was induced by temporary middle cerebral artery occlusion (MCAO). Maltol was administrated once a day for 7 days after MCAO. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) was analyzed by Western blot and immunohistochemistry. Results 7 days after cerebral ischemia reperfusion,the expression of GFAP was increased significantly(P<0.01). Application of maltol could inhibit astrocyte proliferative response( P < 0. 01). Conclusion   Maltol may help create an environment that is more suitable for neuronal survival and regeneration by reducing glial proliferation.

    KEY WORDS: Maltol; Astrocyte; Gliosis; Cerebral ischemia

    海马与学习、记忆、动机及情绪等功能密切相关。局灶性脑缺血可引起其损伤远隔部位的海马出现神经元丢失及神经胶质细胞增殖[1]，形成一种类似海马硬化的病理改变。脑缺血后胶质细胞对神经元的营养支持作用主要发生在早期[2] , 如释放胶质源性神经营养因子的高峰在缺血后的6～12 h ，而胶质细胞的大量增殖却相对迟缓, 其高峰期在缺血后的1周, 且持续1～2 月[3] 。麦芽醇是从红参中提取的单体化合物，其在体内外可与自由基结合，抑制膜脂质过氧化反应[4,5]。为了深入研究麦芽醇的药理作用，寻找安全有效的脑缺血?再灌注损伤的保护药，我们用大鼠脑缺血?再灌注损伤模型，探讨其对胶质增生的影响。

    1  材料与方法

    1.1  试验动物和分组

    成年健康雄性SD大鼠36只，体重230～280g，清洁级，华中科技大学同济医学院试验动物中心提供。随机分为对照组，缺血?再灌注组和麦芽醇组，每组12只。

    1.2   大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型的建立

    参照Koizumi等[6]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌流模型。采用10％水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉,术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃，颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉, 注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0 丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处约1.8～2.0 cm 略感阻力时停止；30min 后拔出丝线进行缺血再灌流。术后在约20 ℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。

    1.3  麦芽醇给药

    有关[7]，麦芽醇组在30min经尾静脉注射2 ml 700μmol/L麦芽醇生理盐水，以后每天1次。

    1.4  标本采集和处理

    再灌后7天断头取手术侧脑海马，各组取6只，-80℃冰箱冻存备用做Western?blot。另外6只常规灌注固定，振荡切片做免疫组化。

    1.5  免疫组织化学方法

    3%H2O2孵育10min，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波修复(96℃～98 ℃)10 min，冷却至室温。正常血清封闭30 min，倾去血清, 滴加GFAP兔多克隆抗体, 4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗稀释液，滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min，DAB显色至自来水终止。脱水、透明并封片。常规设立阴性对照。光镜下观察GFAP的表达, 以胞体及树突棕褐色着色的细胞为阳性表达的细胞。

    1.6   Western blot

    海马样品制备、蛋白浓度测定、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以及转移电泳，最后进行化学发光法显影, 其过程大致如下: 0.1%TTBS 洗PVDF膜，5 %脱脂奶粉封闭2 h，兔多克隆GFAP一抗 4 ℃孵育过夜；0.1% TTBS 洗膜, 1∶2000 稀释的HRP 抗兔二抗室温孵育1 h , 0.1 %TTBS 洗, 15min×4次，最后在暗室中进行化学发光法显影，高敏感胶片(Sigma) 摄片、洗片。

    1.7   统计学处理

    所有实验数据以均值±标准差(±s) 表示。采用SPSS 13.0统计软件处理。各组组间差异比较采用t 检验, 以P <0.05 为差异有显著性。

2   结  果

    2.1   GFAP 免疫组织化学结果

    对照组海马CA1区可见阳性着色的星形胶质细胞，其分布较稀疏, 细胞胞体较小, 突起细小。MCAO 再灌流后第7天海马CA1区存在密集的呈胞体较大、突起短粗、表面粗糙的星形胶质细胞，阳性细胞染色高于对照组。而麦芽醇组阳性细胞染色要低于模型组。见图1。

    2.2   Western blot 检测GFAP 表达

    Western blot 显示出分子量为50kDaGFAP 。缺血组MCAO 再灌流后第7天海马GFAP 表达量较对照组明显增加( P < 0.01)，而麦芽醇组GFAP表达量明显低于模型组( P < 0.01)。见图2。

    3  讨  论

    有关研究表明脑缺血期间缺血边缘区及缺血侧海马大量胶质细胞活化增殖,活化的胶质细胞对于维持脑微环境以及防止神经元死亡起一定的作用,但过度活化的胶质细胞可以释放有害因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、干扰素[8]等导致迟发性神经元死亡（DND）,过度增殖的胶质细胞尤其是胶质疤痕的形成不仅可影响到神经元轴突的生长、突触的重建及阻断脑组织微循环[9],而且是癫痫发病的根源,因此胶质细胞对神经元的作用具有利弊双重性，有必要调控脑缺血后星形胶质细胞的反应,使之最大程度上发挥有利作用而抑制其有害作用。GFAP 是星形胶质细胞中间丝蛋白的主要组成部分, 其表达量的增加通常被作为星形胶质细胞在中枢神经系统(CNS) 损伤后活化和增殖的标志[10]。

    麦芽醇是从红参中提取的单体化合物，我们以前的研究表明麦芽醇能够清除氧自由基，减轻能量耗竭和Ca2+超载，抑制神经元凋亡从而在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用。本研究的结果显示,脑缺血再灌注后GFAP表达升高，表明脑缺血再灌注损伤诱导星形胶质细胞增生，麦芽醇后，GFAP表达下降，表明麦芽醇可抑制在脑缺血损伤后出现的星形胶质细胞过度的增殖及反应, 从而有可能为神经再生和功能重建提供更有利的生存环境。其具体机制有待进一步研究。

【】
  [1]Butler TL,Kassed CA，Senberg PR,et al.Neurodegeneration in the rat hippocampus and striatum after middle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,2002,929(2):252

[2]Song SJ,Wu GP,Wen SQ,et al.The changes of serum bFGF in patients with acute creebral infarction and its clinical significance[J].Chin J Emerg Med.2003，12:400

[3]Cheung WM.Changes in the level ofglial fibrillary acidic protein(GFAP)after mild and severe focal cerebral ischemia[J].Chin J Physiol,1999，42:227

[4]冯立明，蔺福宝，潘华珍，等．麦芽醇抗人红细胞膜氧化的研究[J]．药通报，1990，11(2):224

[5]刘明，杨伟宗，项明洁，等．麦芽醇对提高兔抗氧化能力的研究[J]．九江医学，1999，14(2)：65

[6]Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1

[7]Bertholf RL,Herman MM,Savory J,et al.A longterm intravenous model aluminum maltol toxicity in rabbits:tissue distribution,hepatic,rental and neuronal cytokeletal changes associated with systemic exposure[J].Toxical Appl Pharm,1989,98:58

[8]Loddick SA,Turnbull AV,Rothwell NJ.Cerebralinterleukin?6 is neuroprotective during permanentfocal cerebral ischemia in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab,1998,18:176

[9]方燕南,黄海威,林健雯，等.星形胶质细胞活性及GFAP在评价脑梗塞中的作用及意义[J].中国病理生理杂志,2002，18(6):643

[10].王玉珍,赖真,耿小茵,等.鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞的变化及补阳还五汤对其的影响[J].中国基层医药,2005,7:901