中药联合TTT对视网膜神经保护作用的实验研究

【摘要】  目的：观察归芍地黄汤联合经瞳孔温热疗法（TTT）对兔视网膜神经的保护作用。方法：30只成年青紫蓝兔随机分为正常对照组、模型组、TTT组、中药治疗组、中药联合TTT治疗组5组，每组6只。将除正常对照组外的其余动物均造成脉络膜新生血管（CNV）模型。造模4 w 后，中药治疗组、中药联合TTT治疗组予归芍地黄汤灌胃，剂量为4.63 g/（kg·d），每日1次，持续至造模后8 w；将TTT治疗组、中药联合TTT治疗组动物置于固定箱中，0.5%美多丽-P滴眼液双眼散瞳，0.4%倍诺喜行眼表麻醉后，在全视网膜镜下行TTT治疗。8 w后取眼球壁组织行HE染色，轴突用丽春红-亮绿染色法。结果：造模8 w后HE检查结果可见CNV；轴突染色结果显示中药联合TTT治疗组轴突染色面积和积分光密度值高于TTT治疗组和中药治疗组。结论：归芍地黄汤联合TTT对年龄相关性黄斑变性有更好的治疗效果。

【关键词】  年龄相关性黄斑变性；脉络膜新生血管；经瞳孔温热疗法；神经保护作用

    Abstract    Objective:To observe the protective effect of Guishao Dihuang decoction combined with transpupillary thermotherapy（TTT） on retina nerve of rabbits.Methods：30 rabbits were randomly divided into five groups（n=6）：normal control group，model group， TTT treatment group，TCM treatment group and TCM combined with TTT treatment group.Choroidal neovascularization（CNV） animal models were induced with semiconductor laser.8 weeks later，the histological changes of retina，choroid of rabbits were observed and the area and MOD of axon in inner plexiform layer of retina were measured under light microscope.Result：The area and MOD of axon in TCM combined with TTT treatment group were significantly higher than those in TTT treatment and TCM treatment group.Conclusion：Guishao Dihuang decoction combined with TTT has a better therapeutic effect for age-related macula degeneration.

    Key words   age-related macula degeneration，choroidal neovascularization，transpupillary thermotherapy，neuroprotective effect      年龄相关性黄斑变性（AMD）属于祖国医学“视瞻昏渺”的范畴，医学对其治疗方法有新生血管内皮细胞生长因子（VEGF）抑制剂、光动力疗法（PDT）和经瞳孔温热疗法（TTT）。VEGF抑制剂、PDT治疗AMD费用昂贵，而TTT可以有效地封闭脉络膜新生血管（CNV），且价格适中，但有报道显示其能量不容易掌握，有损伤正常视网膜神经纤维层的危险。中药在阻止渗出型年龄相关性黄斑变性渗出期的形成、防止瘢痕修复后复发、延长患者保持有用的视功能、减缓疾病的发生和方面具有一定的优势。临床观察显示，中药联合TTT可以有效地治疗CNV。本实验旨在观察归芍地黄汤联合TTT在抑制CNV中的神经保护作用，以探讨其作用机理。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   成年青紫蓝兔30只（约6月～7月龄），普通级，体重（2 500±20）g。

    1.1.2   实验药物   归芍地黄汤，由福建中医学院附属人民药剂科提供，每毫升含生药3.11 g。

    1.2   实验方法

    30只成年青紫蓝兔随机分为正常对照组、模型组、TTT治疗组、中药治疗组、中药联合TTT治疗组5组，每组6只。将正常对照组外的其余动物均造成CNV模型。造模方法：以0.5%美多丽-P滴眼液双眼散瞳，0.4%倍诺喜行眼表麻醉后，在全视网膜镜下用半导体激光（波长532 nm）于视乳头下方作视网膜光凝。照射部位位于视乳头及髓线下方，以光凝后有气泡产生为击破Bruch膜的标志 ［1］，激光参数：功率625 mW～750 mW，时间0.1 s，光斑直径50 μm，点数40点。少量激光斑出血，以全网膜镜压迫止血。造模4 w后，中药治疗组、中药联合TTT治疗组予归芍地黄汤灌胃，剂量为4.63 g/（kg·d），每日1次，持续至造模后8 w。根据免疫荧光FFA检查结果，将TTT治疗组、中药联合TTT治疗组动物置于固定箱中，0.5%美多丽-P滴眼液双眼散瞳，0.4%倍诺喜行眼表麻醉后，在全视网膜镜下行TTT治疗。激光能量为200 mW，光斑直径为2 000 μm，照射时间为60 s，照射CNV部位，照射后照射区域无反应或呈淡灰色反应。

    1.3  指标观察

    光凝8 w后处死动物，取动物眼球置于10%中性福尔马林液中，同时将该固定液注入玻璃体腔内，将固定好的眼球去除多余组织，留取激光斑部位眼球壁组织，正常对照组留取相应部位组织，常规石蜡包埋、切片，行HE染色，在光学显微镜下主要观察视网膜和脉络膜组织学变化。轴突染色用丽春红-亮绿染色法，于×400目镜下观察，用Mias-2000图形分析系统行内网状层面积测定，并测定该测量框内染成蓝绿色的轴突的面积、积分光密度。

    1.4   统计学方法

    采用SPSS12.0统计软件，行单因素方差分析。

    2   结   果

    2.1   HE染色结果

    正常对照组视网膜、脉络膜各层结构整齐，细胞结构正常。模型组、TTT组、中药治疗组、中药联合TTT治疗组均可见视网膜神经节细胞不同程度减少，内颗粒层和外颗粒层结构不清，激光斑处色素上皮层基本消失，视网膜、脉络膜黏附在一起，激光斑下可见成纤维细胞，可见CNV，其血管管径较小，血管壁内皮细胞核肿胀，较圆。结果见图1。

    2.2   轴突染色结果

    视网膜内被染成蓝绿色的轴突集中在神经纤维层、内丛状层和外丛状层，兔子的神经纤维层、外丛状层极薄，只有极少量的轴突着色，不易观察，内丛状层较厚，可见轴突分布成网状。正常对照组轴突分布整齐、密集；模型组分布较稀疏，不够整齐；中药治疗组、中药联合TTT治疗组和模型组镜下观察无明显区别。结果见图2。采用Mias-2000型图象分析系统加以测定、比较，结果见表1。

    3   讨   论

    归芍地黄汤最早见于《病因脉治》，此方以六味地黄汤为基础方，配以白芍补血养肝、当归养血补血，用于治疗肝肾亏虚之内障诸疾 ［2］。TTT可有效地封闭CNV。我科长期以来运用二者联合治疗AMD，临床疗效确切，我们据此选择了TTT联合中药进行进一步的实验研究，通过轴突染色来观察二者联合运用对视网膜的神经保护作用。实验结果显示，模型组轴突面积、积分光密度都有下降，而治疗组都有不同程度升高，其中中药联合TTT治疗组的轴突面积和积分光密度最高。前期实验研究显示TTT对于PEDF具有上调作用，PEDF具有神经保护作用，视网膜色素上皮对于视网膜神经上皮的作用是显而易见的，在去除视网膜色素上皮的情况下，光感受器神经元迅速出现变性。PEDF在没有视网膜色素上皮时能够起到支持光感受器神经元正常发育和视蛋白正常表达的作用，避免光感受器变性 ［3］。Müller细胞也与光感受器细胞形成功能复合体，Müller细胞正常的功能和谷氨酸合成酶的表达对于光感受器（下转第23页）（上接第15页）外节盘膜的装配具有重要作用。Müller细胞正常功能的维持依赖于视网膜色素上皮的存在。视网膜色素上皮去除后，PEDF同样可以支持Müller细胞的正常发育和谷氨酸合成酶的表达 ［4］。上述研究结果证实PEDF对维持光感受器细胞正常功能起重要作用。PEDF不但对神经视网膜有营养作用，对RPE细胞同样发挥作用。有实验研究发现PEDF增加新生白鼠培养视网膜RPE细胞中色素颗粒的含量并促进其成熟，表明PEDF对RPE细胞的分化也有调节作用 ［5］，而中药药理研究证明归芍地黄汤的组成方药具有抗炎、抗损伤、抗衰老、调节免疫等多种功效。当归还具有抗凝血、促进凝血的双向调节作用，对于缺血损伤组织具有保护作用，所以治疗组轴突的含量均有升高。如前所述，PEDF有神经保护作用，而TTT治疗组的轴突升高幅度却比不上其他两个治疗组，究其原因，可能与中药对于神经保护的作用优于TTT诱导的PEDF上调的神经保护作用，而TTT本身也可能损伤视网膜神经组织有关。总之，TTT、中药归芍地黄汤可以保护半导体激光诱导的CNV动物模型的视网膜神经纤维层，中药联合TTT的治疗效果优于单纯中药或单纯TTT的治疗效果。

【】
  ［1］Dobi E T，Puliafito C A，Destro M.A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat［J］.Arch Ophthalmol，1989，107（2）：264-269.

［2］李坤吉.实用中医眼［M］.重庆：重庆出版社，1987:191.

［3］Jablonski M M，Tombran-Tink J，Mrazek D A，et al.Pigment epithelium-derived factor supports normal development of photoreceptor neurons and opsin expression after retinal pigment epithelium removal［J］.Neurosci，2000，20（19）：7 149-7 157.

［4］Jablonski M M，Tombran-Tink J，Mrazek D A，et al. Pigment epithelium-derived factor supports normal Muller cell development and glutamine synthetase expression after removal of the retinal pigment epithelium［J］.Glia，2001，35（1）：14-25.

［5］Malchiodi-albedi F，Feher J，Caiazza S，et al.PEDF （pigment epithelium-derived factor） promotes increase and maturation of pigment granules in pigment epithelial cells in neonatal albino rat retinal cultures［J］.Int J Dev Neurosci，1998，16（5）：423-432.