紫外线照射的供体脾细胞预输注对大鼠同种异体神经移植的影响

【摘要】  目的：探讨大鼠尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞在同种异体坐骨神经移植中的作用。方法：20只雄性Wistar大鼠随机分为未经紫外线照射的供体脾细胞注射组（非照射组）、经紫外线照射的脾细胞注射组（照射组）两组，每组10只。未照射组注射未经紫外线照射的供体脾细胞，照射组注射经紫外线照射的脾细胞，7 d后移植供体神经。术后7 d行外周血T淋巴细胞亚群检查，术后8 w行移植神经组织学检查。结果：照射组CD4+百分率、CD4+/CD8+比值较非照射组明显降低（P<0.01，P<0.05），CD8+百分率较非照射组明显升高（P<0.01）。组织学检查显示，照射组的再生神经较非照射组多。结论：尾静脉内注射经紫外线照射的异基因脾细胞可诱导对异体神经移植的特异性免疫耐受。

【关键词】  紫外线；脾细胞；免疫耐受；坐骨神经

    Abstract    Objective:To observe the effect of infusion of UVB-irradiated donor splenocytes on allogeneic transplantation of sciatic nerve of rats.Methods：20 male Wistar rats were randomly divided into UVB irradiated group and nonirradiated group（n=10）.Irradiated and nonirradiated splenocytes were injected in the recipient rats through caudal vein respectively. Then transplantation of the sciatic nerve from donor rats to the recipient rats in two groups were progressed.7 days after nerve transplantation，the contents of CD4 and CD8 in peripheral plasma of recipient rats were detected by flow cytometry.8 weeks after nerve transplantation，transplanted nerve were observed under light microscope.Results：Compared with nonirradiated group，the percentage of CD4 and the ratio of CD4 to CD8 in UVB irradiated group were significantly decreased（P＜0.05，P＜0.01），CD8 percentage was significantly increased（P＜0.01）.Conclusion：UVB-irradiated donor splenocytes were injected in the recipient rats through caudal veil，which could induce immunological tolerance to allogeneic transplantation.

    Key words   ultraviolet，spleen cells，immunological tolerance，sciatic nerve      紫外线照射可抑制急性排斥反应，向受体预输注经紫外线照射的供体血液可延长移植物生存时间，并诱导对同种异体移植物的特异性免疫无反应性 ［1-2］。本实验旨在观察紫外线照射供体脾细胞预输注对同种异体大鼠神经移植的影响，探讨紫外线免疫调节的作用机制，寻找诱导免疫耐受的方法。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   SD大鼠10只，供体鼠，雄性，3月～4月龄，清洁级，体重200 g～240 g；Wistar大鼠20只，受体鼠，雄性，3月～4月龄，清洁级，体重200 g～240 g。均由山西医科大学实验动物中心提供。

    1.1.2   试剂与仪器   PE标记的大鼠CD4单克隆抗体和FITC标记的大鼠CD8单克隆抗体（美国BD公司）；淋巴细胞分离液（天津TBD灏洋）；中波紫外线荧光灯（北京中瑞达电光源厂提供）；紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂）。

    1.2   实验方法

    1.2.1   脾细胞的制备   取成年供体SD大鼠用10 g/L戊巴比妥钠（30 mg/kg～50 mg/kg）腹腔注射麻醉，于大鼠右肋缘下剪去体毛，消毒后无菌摘取脾脏，放入预制冷的RPMI-1640液中。剪碎后经300目尼龙网过滤，即制成单细胞悬液。离心洗涤后，用淋巴细胞分离液分离脾细胞，再用RPMI-1640液洗涤2次后离心，将离心后的脾细胞悬液移到盛有RPMI-1640液的培养皿中。

    1.2.2   分组与给药   20只雄性Wistar大鼠随机分为非紫外线照射的供体脾细胞注射组（非照射组）、经紫外线照射的脾细胞注射组（照射组）两组，每组10只。两组Wistar大鼠分别用戊巴比妥钠（30 mg/kg～50 mg/kg）腹腔注射麻醉，做大鼠右侧臀部至大腿后外侧弧形切口，在距坐骨神经起始部1 cm以远处切断坐骨神经约1 mm。非照射组注射非紫外线照射的供体脾细胞，照射组注射经紫外线照射的脾细胞，制备的受体脾细胞用中波紫外线荧光灯照射，以国产数字式UV光度计测量照射强度，强度剂量为1 200 J/m2，用0.2%台盼蓝染色计数细胞活率大于95%，照射后的脾细胞经尾静脉缓慢注射给受体Wistar大鼠2.5×107个细胞。7 d后移植供体神经，用9～0号显微缝线等间距缝合神经外膜3针，逐层缝合臀部肌肉、皮肤。

    1.3   指标观察

    1.3.1   免疫学检测   所有大鼠于第7 d腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠溶液，剂量30 mg/kg。然后注入125 U/mL肝素抗凝，应用流式细胞仪，通过微量全血直接免疫荧光染色法测定外周血T淋巴细胞亚群。

    1.3.2   组织学检查   神经移植8 w后，取各组大鼠移植段神经，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚5 μm，HE染色，光镜下观察。

    1.4   统计学方法

    实验结果以均数±标准差（x±s）表示， 各组数据行正态检验，方差齐性检验，然后做方差分析。

    2   结   果

    2.1   术后7 d两组T淋巴细胞亚群及CD4+/CD8+比较

    结果见表1。由表1可以看出，术后7 d外周血T淋巴细胞亚群检查中，照射组CD4+百分率、CD4+/CD8+比值较非照射组明显降低（P＜0.01，P＜0.05），照射组CD8+百分率较非照射组明显升高（P＜0.01）。表明尾静脉预输注经紫外线照射的供体脾细胞减弱了近期内（2 w内）的特异性免疫反应。

    2.2   组织学检查 

    术后8 w，神经移植中段横切片低倍镜下显示：照射组再生移植段内的神经纤维数量多，神经纤维之间可见新生的毛细血管，明显多于非照射组。高倍镜下显示：有髓神经纤维呈圆形，每条神经纤维中央为浅蓝色圆形的轴突断面，其外粉红色网状结构即髓鞘。照射组中有散在的慢性炎症细胞如淋巴细胞、浆细胞，非照射组慢性炎症细胞较照射组稍多。纵切片上显示大量神经纤维、雪旺细胞和血管池。

    3   讨   论

    紫外线照射供体特异性抗原诱导免疫耐受的概念早在1983年就已提出，其理论基础是移植物所载的抗原提呈细胞（APC）是触发排斥反应的首要因素，而紫外线照射可以灭活供体移植物或血中的APC ［1］。进一步研究表明淋巴细胞经紫外线照射后，降低了HLA-Ⅱ抗原在细胞表面的表达，而且细胞因子IL-2的产生也受到显著影响 ［3］。因此预注射经紫外线照射的供体脾细胞，在不能正常提呈抗原诱发受体免疫排斥的同时，使受体产生对供体的特异性免疫耐受。我们用预输注经紫外线照射的供体脾细胞，成功地诱导了受体鼠对供体鼠坐骨神经移植的免疫耐受。本研究结果显示照射组较非照射组的CD8+ T细胞的百分率升高，CD4+ T细胞的百分率降低，CD4+/CD8+比值下降，提示预输注经紫外线照射的供体脾细胞能够诱导受体特异性免疫反应降低。这可能是由于紫外线照射所产生的生物学效应抑制或阻断了脾淋巴细胞表面抗原分子的表达，使其不能被受体免疫细胞特异性识别，受体不能破坏杀伤输入体内的供体脾细胞，且能诱导出抑制性T细胞，从而对供体神经移植物产生免疫耐受。

    总之，紫外线照射淋巴细胞促进移植神经再生并降低免疫排斥反应的作用，值得进一步研究。寻找最适紫外线波长和辐射剂量，以及诱导耐受途径，将有可能成为解决同种异体神经移植免疫排斥的新方法。

【】
  ［1］Lau H，Reemtsma K，Hardy M A.Pancreatic islet allograft prolongation by donor-specific blood transfusions treated with ultraviolet irradiation［J］.Science，1983，221（4 621）：754-756.

［2］Hardy M A，Oluwole S F，Lau H T.Ultraviolet B-modified donor-specific blood transfusions and peritransplant cyclosporine in the induction of specific unresponsiveness to organ allografts［J］.Transplant Proc，1988，20（6）：1 147-1 150.

［3］张建，刘强，吴斗.大鼠输注经紫外线照射的供体脾细胞后移植中T淋巴细胞亚群变化［J］.山西中医学院学报，2008，9（2）：48-49.