抗感染喷剂对切线伤模型SD大鼠创伤修复中bFGF及TGF-β1的影响

                   作者：窦群立，刘波，杨锋，钱来军，焦海彬

【摘要】  目的：观察抗感染喷剂对SD大鼠软组织切线伤模型肉芽组织中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）的影响，探讨抗感染喷剂在创伤修复中的作用。方法：30只大鼠随机分为空白组、湿润烫伤膏对照组（对照组）和抗感染喷剂组（治疗组）。造模后空白组用生理盐水喷洒创面，对照组用湿润烫伤膏涂抹创面，治疗组用抗感染喷剂喷洒创面。应用免疫组化法测定SD大鼠软组织切线伤模型肉芽组织中bFGF、TGF-β1 含量的变化。结果：治疗组及对照组肉芽组织中 bFGF 、TGF-β1水平高于空白组（P<0.01，P<0.05）。结论：抗感染喷剂能明显提高bFGF、TGF-β1水平，有促进创伤修复的作用。

【关键词】  抗感染喷剂；创伤修复；bFGF；TGF-β1

    Abstract    Objective:To observe the effect of Kangganran spray on the expressions of bFGF and TGF-β1 in granulation of skin wound model rats.Method：30 SD rats were randomly divided into Kangganran spray group，Meibao scald paste group and blank group.The expressions of bFGF and TGF-β1 of granulation tissue were detected by immunohistochemistry.Result：Compared with the blank group，the expressions of bFGF and TGF-β1 of granulation tissue were significantly increased in Kangganran spray group and Meibao scald paste group.Conclusion：Kangganran spray can increase expressions of bFGF and TGF-β1  and promote the healing of wound.

    Key words   Kangganran spray，wound repair，bFGF，TGF-β1       目前已公认，生长因子参与调控创伤修复的全过程，其来源主要是巨噬细胞、血小板和内皮细胞，上皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞也可生成生长因子 ［1］。许多生长因子对创伤修复有促进作用，这已得到充分肯定 ［2］。本实验目的是研究抗感染喷剂对切线伤模型SD大鼠创伤修复中bFGF及TGF-β1的影响。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   SD大鼠30只，雌雄各半，体重（200±20）g，清洁级动物，购自西安大学医学院动物实验中心。

    1.1.2   药品与试剂   抗感染喷剂由苦参、黄柏、苍术、艾叶、蚤休等组成，以上药物均购自咸阳市药材公司，经陕西中医学院药物研究所鉴定，符合2000年版《中华人民共和国药典》质检标准。上述各味饮片经提纯加工成每毫升相当于原药材3.5 g的喷雾剂，由陕西中医学院附属制剂中心制备，置冰箱4 ℃保存备用。美宝牌湿润烫伤膏，国药准字Z20000004，由北京光明中医烧伤创疡研究所汕头特区美宝制药厂提供。bFGF抗体由北京中杉生物技术有限公司提供，兔抗人TGF－β1抗体、生物素化羊抗鼠IgG、ABC试剂盒、DAB显色剂均由北京博奥森生物技术有限公司提供。

    1.1.3   实验仪器   日本OLYMPUS CHB-213照相显微镜， Mplas-500多媒体彩色病理图文分析系统，石蜡切片机，光学显微镜。

    1.2   实验方法

    1.2.1   造模   采用付小兵等 ［3］报道的皮肤切线伤模型造模方法。将SD大鼠适应性喂养，实验前1 d脱毛、称重。SD大鼠腹腔内麻醉（3%戊巴比妥钠25 mg/kg），消毒后，用利刀在脊柱两侧切约2 cm～4 cm线型切口，可深达筋膜，伤腔中植入一种多孔硅胶管约2 cm，缝合伤口，手术4 h完成。

    1.2.2   分组与给药   30只SD大鼠随机分为空白组、湿润烫伤膏对照组（对照组）、抗感染喷剂治疗组（治疗组）3组，每组10只，称重标记。饲养环境温度保持在26 ℃，室内湿度控制在70%左右，自动通风器保持室内通风。造模成功后，第2 d开始用药，大鼠用药量按［4］方法折算。治疗组用抗感染喷剂5 mL/只 喷洒；对照组用湿润烫伤膏在创面处直接涂药1 mm厚，覆盖创面周围2 cm范围；空白组用生理盐水喷洒创面。以上各组每日治疗2次，共治疗2 w。2 w后处死动物，取出多孔硅胶管中肉芽组织，立即置入预备好的中性福尔马林缓冲液中单瓶保存，常规石蜡包埋，连续切片（采用多聚赖氨酸处理载玻片）备免疫组化用。

    1.2.3   免疫组化染色   石腊包埋、切片、铺片，制备5 μm切片，常规脱水、透明，烤箱60 ℃烘烤2 h，用3%H2O2，室温5 min～10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热抗原修复，将切片浸入0.01 M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，电炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复1次～2次。冷却后0.1 M  PBS洗涤2次，经甲醇、双氧水封闭内源性氧化物酶，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩出多余液体，不洗涤，分别滴加bFGF、TGF-β1多克隆抗体，工作液浓度1∶70，4 ℃冰箱孵育过夜，室温复温1 h。此后依次滴加生物素标记的第二抗体及HRP-链霉素标记物各30 min，室温显色，镜下控制DAB显色，上述各步骤后均用PBS液振洗5 min，2次，脱水，透明，封片，显微镜观察。PBS代替抗原作为阴性对照。

    1.2.4   观察指标   光学显微镜（10×40倍）观察bFGF 、TGF-β1免疫阳性细胞的分布，用Mplas-500多媒体彩色病理图文分析系统，通过显微摄像系统放大400倍。每张切片随机选取5个视野, 在该视野中选定bFGF、TGF-β1阳性细胞标准，以图像分析系统自动测量结果，单位μm2。阴性对照以PBS替代bFGF、TGF-β1多克隆抗体。

    1.3   统计学方法

    实验数据以（x±s）表示，结果用单因素方差分析,组间用q检验。采用SPSS11.5软件包进行方差分析。

    2   结   果

    2.1   抗感染喷剂对软组织切线伤模型SD大鼠生长调节因子表达的影响  

    结果见表1。由表1可以看出，造模2 w后，对照组、组bFGF（+）、TGF-β1（+）表达面积增加，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。

    3   讨   论

    90年代以来，国内外许多学者将bFGF用于创伤后创面及缺血后皮瓣，发现可促进创面愈合，提高皮瓣存活率 ［6］。有实验表明在内皮细胞培养时给予bFGF可使内皮细胞的bFGF表达增加，如果阻断bFGF的表达，bFGF就不能诱导内皮细胞形成血管；如果抑制bFGF表达，则bFGF使血管形成的时间大大推迟 ［6］。研究表明bFGF是具有多项功能的生长因子，能促进胶原纤维和弹力纤维合成增加，也能作用于上皮细胞使其增殖加快。bFGF尚能激活胶原酶，降解过多的胶原，在创伤修复中使肉芽生长不致失控而形成疤痕。同时，bFGF作为生长因子有其非特异调理作用，能促进炎性细胞（包括白细胞、单核细胞等）吞噬细菌及组织碎片，改善局部组织环境而有利于伤口的愈合 ［7］。

    EGF-β1是启动和终止组织修复的重要细胞因子，皮肤伤口的愈合是组织修复的经典例子，是一系列生物学活动协调的结果。以血小板引起止血开始，随后炎细胞、成纤维细胞进入损伤部位，新的ECM及血管生成（即肉芽组织形成），细胞增殖而重新构建组织，TGF-β1在每一步中都起着重要作用。血小板进入损伤部位后，其富含的TGF-β1和PDGF释放出来，进入组织，与局部ECM结合的TGF-β1前体在损伤后被活化。TGF-β1对中性粒细胞、T细胞、单核细胞和成纤维细胞有强烈的趋化作用，这些细胞在向损伤部位移动的过程中遇到TGF-β1时即被激活，单核细胞开始分泌TGF、TNF和IL-1，成纤维细胞则增加ECM合成。TGF-β1还能诱导浸润细胞及常居细胞产生更多的TGF-β1，这种自我诱生增加了TGF-β1在损伤部位的生物学效应，这可能在创面修复中起着重要作用 ［8-9］。

    抗感染喷剂是我院骨科40年来临床应用促进创伤修复的有效方剂，未发现不良反应及毒副作用。抗感染喷剂是以抗感染洗剂为基础方剂制备的新剂型，全方由苦参、黄柏、苍术、艾叶、蚤休、花椒6味中药组成，方中以苦参、黄柏清热燥湿、杀虫解毒，大黄清热泻火、凉血活血，艾叶温经通经，丹参活血化瘀、凉血解毒、消肿止痛，苍术、蚤休燥湿杀虫止痒，花椒温中散寒、祛风杀虫止痛。诸药合用，寒热并举，既能清热解毒、凉血止血，又能温经通经、活血消肿。开放性感染损伤为皮肉受损，复感外邪而致经络阻遏，血瘀化热，热毒弛张，肉腐成脓而致，用该方治疗甚为妥当。抗感染喷剂在创伤修复中的作用机理可能为促使bFGF、TGF-β1增（下转第53页）（上接第15页）多，促进细胞增生，减少创伤后瘢痕形成，同时对体表软组织创伤修复起作用。

【】
  ［1］Kerstein M D.The physiology of wound healing［M］.Pennsylvania：All egheny University of the Health Sciences，1998：21-23.

［2］王正国.创伤修复的分子生物学研究［J］.中华创伤杂志，2000，16（6）：326-327.

［3］付小兵.生长因子与创伤修复［M］.北京：人民军医出版社，1991：2 529.

［4］施新献.实验动物学［M］.北京：人民军医出版社，1999.

［5］屈纪富，程天民，郝利.参加皮肤伤口愈合的细胞及其作用的研究进展［J］.现代康复，2001，5（12）：74-75.

［6］Hadari Y R，Kouhara H，Lax I，et al. Binding of Shp2 tyrosine phosphatase to FRS2 is essential for fibroblast growth factor-induced PC12 cell differentiation［J］.Mol Cell Biol，1998，18（7）：3 966-3 973.