十二味液化散质量标准的研究

【摘要】  目的：建立十二味液化散的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法对制剂中主要药材赤芍、丹参、黄柏、陈皮进行定性鉴别，采用HPLC测定丹参中丹参酮ⅡA的含量。结果：鉴别方法专属性强，定量方法简便、准确。丹参酮ⅡA在5.440 μg~32.640 μg范围内呈良好的线性关系（r=0.999 966 3），平均回收率为99.99％（n=5），RSD＝0.3。结论：本质量标准所用方法准确可靠，可行性及重现性良好，能有效地控制该制剂的质量。

【关键词】  十二味液化散；质量标准；TLC；HPLC；丹参酮ⅡA

    Abstract   Objective:To establish the method for quality control of Shi’erwei Yehua  Powder.Methods：Radix Paeoniae Rubra，Radix Salviae Miltiorrhizae，Cortex Phellodendri and Pericarpium Citri Reticulatae in Shi’erwei Yehua  powder were identified by TLC，the content of tanshinone ⅡA in Pericarpium Citri Reticulatae was determined by HPLC.Results：The method of identification was specific，the quantitative method was simple and accurate.The calibration curve showed a good linear relationship in the range of 5.440 μg~32.640 μg for tanshinone ⅡA，r=0.999 966 3.The average recovery was 99.99%（n=5），RSD=0.3.Conclusion：Two methods are accurate，reliable with good feasibility and repeatability，can be used to control the quality of this powder effectively.

    Key words   Shi’er wei Yehua Powder，quality standard，TLC，HPLC，tanshinone ⅡA 

    十二味液化散由深圳市中提供，由黄柏、女贞子、知母、地黄、赤芍、丹参、炮山甲、三棱、莪术、海金沙、泽泻、陈皮12味中药组成。为了更好地控制该制剂的质量，保证临床用药安全有效，本文对十二味液化散的质量标准进行了研究。根据处方中药材的理化性质，采用薄层色谱法对制剂中黄柏、赤芍、丹参、陈皮4味药材进行了定性鉴别，采用HPLC法测定丹参中丹参酮ⅡA的含量。结果表明该方法操作简便、快速、专属性强、重复性好，结果令人满意，可作为该制剂质量控制的方法。

    1   实验材料

    １.1   实验仪器

    Diamonsil 钻石C18（250 mm×4.6 mm）色谱柱，SPD-10AVP检测器，LC-10ADVP，CS-Light工作站，CTO-10ASVP柱温箱，AG285分析天平，HS2060超声波清洗机。

    1.2   药品与试剂     

    丹参对照药材（批号：923-9001），黄柏对照药材（批号：121510-200501），芍药苷对照品（批号：110736-200527），盐酸小檗碱对照品（批号：713-9003），丹参酮ⅡA对照品（批号：766-200112，HPLC用丹参酮ⅡA对照品批号：110766-200315），均购于药品生物制品检定所；水为乐百氏纯净水；甲醇为色谱纯（天津科密欧）；其他试剂均为分析纯。

    2   方法与结果

    2.1   十二味液化散定性鉴别

    取本品粉末置显微镜下观察：纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。果皮表皮细胞黄棕色或紫棕色，表面呈类多角形，胞间层似细缝状，垂周壁厚，胞腔由深入的外壁分隔成若干个不规则的小腔，胞腔内含黄棕色或紫棕色物。草酸钙针晶成束或散在，针晶长36 μm~110 μm，较细。薄壁细胞类圆形，内含圆形细胞核。草酸钙簇晶众多，散在或存在于薄壁细胞中，常数个或数十个纵向排列成行。孢子黄色，圆锥体状，表面有颗粒状突起。薄壁细胞类圆形，有椭圆形纹孔集成纹孔域。

    2.2   赤芍的薄层鉴别

    取处方粉末10 g，加乙醇50 mL，超声提取20 min，滤过，滤液蒸干，加水20 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，用乙醇1 mL溶解，作为供试品溶液。取芍药苷对照品适量，加乙醇制成2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。除赤芍以外，其余各药按处方比例投料，制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺赤芍的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部 ［1］52附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5 μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（45∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。阴性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无蓝紫色斑点。结果见图1。

    ■

    2.3   黄柏的薄层鉴别

    取处方粉末5 g，加甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至10 mL，作为供试品溶液。取黄柏对照药材50 mg，加甲醇5 mL同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成0.5 mg /mL的溶液，作为对照品溶液。除黄柏以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺黄柏的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部 ［1］109附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照药品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮 -甲酸-水（10∶6∶1∶1）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。阴性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无荧光斑点。结果见图2。

    2.4   丹参的薄层鉴别

    取处方粉末10 g，加乙醚10 mL，振摇，放置1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。取丹参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品适量，加乙酸乙酯制成2 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。除丹参以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺丹参的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部［1］132附录VIB）试验，吸取供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各5 μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗红色斑点。在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。阴性对照品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，无斑点。结果见图3。

    2.5   陈皮的薄层鉴别

    取本品粉末适量，加甲醇20 mL，加热回流20 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 mL，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品50 mg，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。除陈皮以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺陈皮的阴性对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2005年版一部 ［1］214附录VIB）试验，吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各5  μL分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7∶2∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷2%三氯化铝乙醇溶液，挥干后，置紫外灯（365 nm）下检视。因对照品放置时间过长，不显示斑点，故放弃。

    3   含量测定

    3.1   色谱条件与系统适应性实验

    用十八硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水（87∶13）为流动相，检测波长为270 nm。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰不应低于6 000。

    3.2   对照品溶液的制备  

    取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定0.006 8 g，置50 mL棕色的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为初始液；精密量取3 mL，置25 mL棕色瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升含丹参酮ⅡA 16.32 μg）。

    3.3   供试品溶液的制备 

    取本品粉末约4.0 g，精密称定3.453 4 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，精密称定，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

    3.4   阴性对照品溶液的制备

    除丹参以外，其余各药按处方比例制成阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法，制得缺丹参的阴性对照品溶液。

    3.5   测定方法

    精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见图4~图6。

    ■

    3.6   线性关系考察

    精密吸取3.2中初始液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取3.2中对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，丹参酮ⅡA进样量为横坐标，经线性回归，得回归方程为Y=136 019.8 X-1 843.088。结果表明：丹参酮ⅡA在 5.440 μg~32.640 μg范围内线性关系良好。

    3.7   精密度试验

    取丹参酮ⅡA对照品，在上述色谱条件下，连续进样5次，RSD=0.648 578 2，结果表明精密度良好。

    3.8   稳定性试验

    精密吸取对照品溶液， 在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h各进样20 μL，重复5次， RSD=0.9，结果表明丹参酮ⅡA在8 h内稳定。

    3.9   重复性试验

    取同一批样品，按3.3项下方法制备5份供试品溶液，测定含量，RSD=1.2，表明此法重复性良好。

    3.10   干扰试验

    分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各20 μL，按上述色谱条件分别进行测定，结果表明阴性对照溶液对丹参酮ⅡA峰无干扰。

    3.11   加样回收率试验

    精密称取已知丹参酮ⅡA含量同一批号的样品5份，分别加入对照品溶液1.0 mL，按供试品溶液制备及含量测定的方法进行测定，计算回收率。结果见表1。

    ■

    结果表明本测定方法丹参酮ⅡA的平均回收率为99.97%，RSD为0.3，回收率良好。

    3.12   样品含量测定

    取3个批号样品，按3.3项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定丹参酮ⅡA含量，结果样品1的浓度和含量分别为0.018 67 mg/mL和0.36%，样品2的浓度和含量分别为0.018 71 mg/mL和0.36%，样品3的浓度和含量分别为0.018 76 mg/mL和0.36%。

    4   讨   论

    盐酸小檗碱具有一定的极性，在黄柏的薄层鉴别中用氨饱和的展开剂，在实验过程中出现Rf值过小的现象，分析原因可能为氨蒸气饱和时间太短（15 min），将饱和时间延长为25 min后，展开后盐酸小檗碱的Rf值有显著改善 ［2］。

    流动相中甲醇的体积分数很重要，甲醇体积分数过低，样品中各组分能完全分离，但保留时间相对延长，峰有不同程度的扩散；甲醇体积分数过高，保留时间相对缩短，但丹参酮ⅡA与其他峰有重叠，会给分析结果带来误差 ［3］。

    流速的大小直接影响色谱柱系统的压力、各组分分离度、洗脱时间等，流速太小，分析时间过长；流速太大，系统的压力过高 ［4］。实验考察了流速为0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min、1.2 mL/min、1.5 mL/min对分离和测定的影响，确定最佳流速为1.0 mL/min。

【】
  ［1］中华人民共和国卫生部.中华人民共和国药典［M］.北京：化学出版社，2005.

［2］吕武清，龙新华.中成药中的药材薄层色谱鉴别［M］.北京：人民卫生出版社，1997：327-336.

［3］康延国.中成药薄层色谱鉴别［M］.北京：人民卫生出版社，1995：124－126.

［4］张家明，陈耀祖，李伯刚，等.丹参化学成分研究［J］.中药杂志， 2003，22（2），104-106.