利脉胶囊对小鼠学习记忆的影响

                      作者：王帮华， 陈红光，赵骥，郑敏

【摘要】  目的 观察利脉胶囊对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍及正常小鼠空间学习记忆的影响。方法 采用跳台实验观察利脉胶囊（140mg／kg ig qd×14）对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的改善作用，以触电潜伏期及单位时间内错误次数作为学习记忆成绩；采用Morris水迷宫实验观察利脉胶囊（140mg／kg，ig qd×20）对正常小鼠空间学习记忆的影响，以定位航行实验小鼠逃避潜伏期及空间探索实验小鼠经过目标平台次数作为学习记忆成绩。结果 ①跳台试验。第 1d跳台训练，利脉胶囊组3min内跳台错误次数少于模型组 (P<0.01)，而和正常组无显著性差异（P>0.05）。第2d跳台检测，东莨菪碱模型组触电潜伏期较正常对照组明显缩短；利脉胶囊组触电潜伏期显著长于模型组（P<0.01),而与正常对照组接近，5min错误次数有减少趋势。②水迷宫试验。利脉胶囊治疗组逃避潜伏期小于正常组，经过目标平台次数有增加趋势。结论 利脉胶囊对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍有一定的改善作用，并具有一定的促智作用。

【关键词】  利脉胶囊；东莨菪碱；跳台实验；学习记忆；Morris水迷宫实验

    ABSTRACT:Objective To observe the effect of Limai capsule on learning and memory defict induced by scopolamine and spatial memory ability of normal mice.Methods The step?down test and Morris water maze were adopted to observe the effect of Limai capsule (140 mg/kg, ig) on the learning and memory defict induced by scopolamine and spatial memory ability of normal mice respectively.Results ①On the first training day, the error times of Limai capsule group were less than those in model group within 3 minutes (P<0.01). No significant difference was found between Limai capsule group and nomal group（P>0.05）. On the second detected day, the electrical injury latency in model group was less than that in normal group. Compared with model group, Limai capsule could significantly prolong the electrical injury latency and was close to the normal one（P<0.01). ②Compared with normal group, Limai capsule could significantly decrease the escape latency of normal mice but had no effect on the  number of passing through primary flat place in Morris water maze test.Conclusion Limai capsule can improve learning and memory defict induced by scopolamine and has effect on intelligence increase.

    KEY WORDS: Limai capsule;Scopolamine;Learning and memory;Step?down test;Morris water maze

    老年痴呆是老年人致残最严重的疾病之一，主要表现为认知功能的下降和丧失。随着人口的老龄化，痴呆患者日益增多，给家庭和社会带来沉重的负担。因此寻找改善学习记忆障碍及具有促智作用的药物，成为当今国际医药界的重要研究课题。利脉胶囊每粒含阿魏酸钠 50mg、乙酰水杨酸(阿司匹林) 20mg、桂利嗪(脑嗌嗪)25mg、维生素B1 10mg。本品4种成分经组方后有协同作用，具有较强的抗血小板聚集、实验性血栓形成等作用[1]。本研究则进一步观察利脉胶囊对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍及正常小鼠空间学习记忆的影响，为其作为抗痴呆药物用于临床提供理论和实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  药品和仪器

    利脉胶囊（丽珠集团利民制药厂，批号070702），氢溴酸东莨菪碱(上海禾丰制药有限公司，批号071202)。小鼠光电刺激仪（ZH?200型，安徽淮北正华生物仪器有限公司），Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司），精密天平（日本产1472?CHA型）。

    1.2  跳台试验

    健康小鼠60只（体质量20～25g），雌雄各半，随机分为正常对照组、东莨菪碱模型组、利脉胶囊治疗组（140mg／kg，ig qd×14），每组20只。利脉胶囊治疗组每天按既定剂量给药，正常组和模型组灌以等容积生理盐水。第14d小鼠灌胃给药后1h，模型组及利脉胶囊治疗组小鼠均腹腔注射东莨菪碱3mg／kg，正常组腹腔注射等量生理盐水,10min后进行跳台试验。 试验装置为一28cm×13cm×34cm的被动回避条件反射箱，用不透明黑色塑料分隔成两间，箱底有铜栅，间距为0.5cm，可通36V交流电。每一间右后角置一6cm×6cm×3cm 的平台作为动物回避电击的安全区。造模10min后先将动物放入箱中适应环境3min，然后将动物置于铜栅上立即通电。此时小鼠正常反应是跳到安全区以躲避电击。多数小鼠可能从安全平台再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。记录小鼠跳上平台后3min内从平台跳至铜栅上的次数(即错误次数)，以此作为学习成绩。24h后将小鼠放至平台，记录第1次跳下平台的时间即为触电潜伏期和5min内的错误次数作为记忆成绩。如果5min时小鼠未跳下平台，错误次数记录为0次，潜伏期记为300s。

    1.3  Morris水迷宫测试

    健康小鼠40只（体质量20～25g），雌雄各半，随机分为正常对照组及利脉胶囊组（140mg／kg，ig qd×20），每组20只。利脉胶囊组按既定剂量给药，正常对照组灌以等容积蒸馏水。给药后14d，进行Morris水迷宫实验，连续6d。

    Morris水迷宫主要由一个圆形水池和自动录象及分析系统两部分组成。小鼠的水池高30cm，直径 80cm，站台直径5cm，分为4个象限。预先在水池中注入清水，水温控制在(22.0±0.5)℃，加入适量奶粉使水呈乳白色，与站台表面白色相近，使小鼠不能看到站台。每只小鼠头部涂以黑色。水面高出站台表面0.5cm。在水池上各象限标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。

    实验分为3部分：① 学习训练：第1d让小鼠自由游泳2min以熟悉迷宫环境；从第2d起开始训练。将小鼠头朝下面向水池壁依次从NE、SE、SW、NW 4个象限投入水中，每次游泳时间设定为120s。小鼠每次找到平台后，让其在平台上站立20s，巩固记忆，然后将其置于鼠笼休息1min。若小鼠在120s内未爬上安全平台，结束本象限实验，潜伏期记为120s。同时操作者将其引向平台，停留20s后置于鼠笼休息1min再进行下一象限实验。记录从入水点到达站台所需时间以及在这段时间内的游泳路程和经过平台的次数。每次训练4个象限，连续4d。② 定位航行实验：用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。在学习训练结束后第6d进行，将小鼠从某一固定象限如前操作投入水中，记录找到平台的时间为逃避潜伏时间(escape latency，ST)。若120s内找不到平台者，ST记为120s。③ 空间探索试验：在定位航行试验后进行，撤走安全平台，将小鼠从某一固定象限如前操作投入水中，记录大鼠30s穿过平台所在位置的次数和在水池中的游泳路径。

    1．4  统计分析

    采用SPSS 12.0软件进行统计分析。所有数据以±s表示。多组间均数比较采用one?way analysis of variance (ANOVA)及Fisher LSD test(Least?significant difference)分析, P＜0.05 有统计学差异。

    2  结  果

    2.1  跳台试验

    第 1d跳台训练，东莨菪碱模型组跳台错误次数较正常对照组显著增加(P<0.01)， 利脉胶囊组3min内跳台错误次数显著少于模型组 (P<0.01)，而和正常组无显著性差异（P>0.05）。第2d跳台检测，东莨菪碱模型组触电潜伏期较正常对照组明显缩短；利脉胶囊组触电潜伏期显著长于模型组（P<0.01)而与正常对照组接近，5min错误次数有减少趋势，但与模型组无显著差异 。见表1。 表1  利脉胶囊对东莨菪碱致小鼠学习记忆形成障碍的影响与正常对照组比较，* P<0.05;     与模型组比较，△P<0.05,  △△P<0.01

    2.2   Morris水迷宫测试

    利脉胶囊140mg／kg 连续灌胃给药20d后，小鼠Morris水迷宫定位航行实验测试逃避潜伏期显著低于正常对照组（P<0.05）。空间探索实验，利脉胶囊组小鼠经过目标平台次数较正常对照组有增加趋势，但两者无显著性差异（P>0.05）。结果见表2。表2  利脉胶囊对正常小鼠空间学习记忆能力影响与正常对照组比较，* P<0.05

    3   讨  论

    学习是指新行为(经验)的获得和，记忆是指获得的行为(经验)的保持和再现。学习记忆障碍往往表现为获得、巩固及再现缺失3种形式。

    鉴于抗胆碱能药物影响学习记忆机制比较清楚，结果易于重复，且无明显非特异性作用，用于制作记忆获得障碍模型较为理想，在国内外广泛应用。东莨菪碱为M胆碱受体阻断剂，有对抗中枢乙酰胆碱的作用，能模拟乙酰胆碱分泌不足造成可逆的记忆障碍，为此类药物中最常选用，尤其是用于制作为抗痴呆药物研究的初筛模型[2～4]，故而我们选用东莨菪碱制作小鼠获得性学习记忆障碍模型，并观察利脉胶囊对此类认知障碍有无改善作用。实验中利脉胶囊剂量选用[1]既定剂量之一。结果表明，利脉胶囊对东莨菪碱所致的获得性学习障碍改善作用明显，表现在第1d跳台训练，小鼠跳下安全平台的次数显著低于东莨菪碱模型组；对东莨菪碱所致的获得性记忆障碍也有一定作用表现;在第2d跳台试验检测小鼠触电潜伏期较模型组显著延长甚至与正常组接近；第2d各组错误次无显著差异，但利迈组错误次数有减少趋势，表明该剂量利脉胶囊对记忆再现和巩固影响不明显，增大剂量可能有一定的改善作用。

    Morris水迷宫法是目前广泛用于研究动物学习、记忆、空间定向和认知能力的理想方法。实验结果发现，小鼠Morris水迷宫定位航行实验测试，利脉胶囊组逃避潜伏期显著低于正常对照组(P＜0.05)，空间探索实验，利脉胶囊组小鼠经过目标平台次数较正常对照组有增加趋势，但两者无显著性差异，表明利脉胶囊对小鼠空间定向学习能力有一定的促进作用，而对空间定向记忆促进作用尚不明显。基于上述研究结果，我们认为利脉胶囊作为抗痴呆治疗及促智药物应用有一定的前景，其组方存在一定的合理性，可在多种学习认知障碍动物模型上进一步深入研究。

【文献】
  [1]广东利民制药厂医药研究所. 利脉胶囊(复方阿魏酸钠)的抗小亩板聚集和抗血栓作用[J]. 临床神经，1993，1(1):32

[2]徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2001:829

[3]李 斌，郭德玉，李林．三种老年痴呆动物模型行为学比较[J]．实验动物学报，1999，7(1)：37

[4]朴景华，蒲小平，马建．类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用 [J]．中国药通报，2001，17 (6)：625