麦芽醇对AD大鼠空间记忆障碍的影响
【摘要】 目的 探讨麦芽醇对AlCl3致阿尔茨海默病（AD）大鼠的影响。方法 采用AlCl3灌胃制作AD大鼠模型，Morris 水迷宫检测大鼠空间记忆能力，免疫印迹检测tau蛋白磷酸化水平。结果 麦芽醇明显缩短大鼠寻找平台的时间，降低tau蛋白磷酸化水平。结论 麦芽醇能有效改善因AlCl3所致的大鼠空间记忆障碍，其机制可能与抑制tau蛋白过度磷酸化有关。
【关键词】 麦芽醇；阿尔茨海默病；空间记忆；tau蛋白
ABSTRACT: Objective To investigate the effect of maltol on learning and memory ability of Alzheimer′s disease (AD) rats.Methods The AD model was established by aluminum chloride toxicity. The spatial memory deficity was assessed by Morris water maze and phosphorylation of tau protein was detected by western blot. Results It was shown that maltol could significantly shorten the increase of escape latency induce by aluminum chloride, decrease tau hyperphosphorylation. Conclusion Maltol can effectively prevent spatial memory deficit induced by aluminum chloride through inhibiting tau hyperphosphorylation.
KEY WORDS: Maltol;Alzheimer′s disease;Spatial memory;Tau protein
麦芽醇是从小麦、大豆等的水解液中提取的单体化合物，其在体内外可与自由基结合，抑制膜脂质过氧化反应[1,2]，在阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）中的作用未见报道。AD是老年人常见的一种慢性进行性神经退行性疾病,目前针对AD的药物效果不明显。由于AD的发病原因及机制没有完全清楚，研究开发出真正具有预防或治疗作用的药物将有广阔的前景和深远的意义。本实验拟观察麦芽醇对三氯化铝（AlCl3）诱导的AD模型大鼠的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物和分组
成年健康雄性SD大鼠60只，体质量200～250g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。随机分为对照组（Con）、AD模型组(AD)、麦芽醇组(maltol，MT)，每组10只。
1.2 造模与用药
AD模型组、麦芽醇组每日上午给予AlCl3（200mg/kg）灌胃，1次/d，连续9周；麦芽醇组自AlCl3灌胃第7d开始，除上午给予AlCl3外，每日下午给予麦芽醇10mg/kg灌胃，1次/d，连续8周，以上参照[3]。
1.3 Morris 水迷宫检测
造模结束后进行Morris 水迷宫检测。测试用圆形水池直径120cm，高60cm；圆柱形有机玻璃平台直径10cm，高40cm，平台的顶端平面低于水池液面2cm。室温及水温均保持在（26±2）℃，水以奶粉搅浑，整个背景均为乳白色，以避免老鼠用视觉搜寻平台。大鼠在训练前放入水池自由游泳120s，使其熟悉环境。训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头面向池壁轻放于水中，其游泳图像经水面上方1.5m处的摄像机拍摄并连接于路径追踪系统采集，通过微机分析，可提供潜伏期（即老鼠从入水点找到平台所用时间）、路径、搜索策略等指标，本实验选用潜伏期和游泳路径衡量大鼠学习和记忆成绩。每只大鼠每天在4个象限各训练1次，每次游泳时间限为120s，若在120s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记为120s，由测试者引导其上台，休息30s后进行下一次训练。采用的实验策略为每组大鼠于第8周末开始连续训练7d，以大鼠第7d训练的成绩作为测试成绩，训练时间每天固定在2∶00pm 到8∶00pm。将各组所得的成绩作比较，可反映大鼠空间记忆保留情况。
1.4 免疫印迹检测
水迷宫测试后立即将大鼠颈椎脱臼断头处死，随后行海马样品制备、蛋白浓度测定、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以及转移电泳，最后进行化学发光法显影, 其过程大致如下: 0.1%TTBS 洗PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，1∶200兔多克隆R134d、PS396一抗(Santa Cruz Biotech, Inc.)4 ℃孵育过夜; 0.1 % TTBS 洗膜, 1∶200 稀释的HRP 抗兔二抗室温孵育1 h,0.1%TTBS 洗, 15min ×4 次,最后在暗室中进行化学发光法显影，高敏感胶片摄片、洗片。
1.5 统计学分析
所有描述性数据用平均数±标准差 (±s)表示，统计学分析应用统计软件SPSS10.0中方差分析，P<0.05表示差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 Morris水迷宫
与对照组比较，AD模型组大鼠搜寻水迷宫平台的时间延长，搜寻轨迹杂乱，大鼠表现空间记忆保留障碍(P＜0.01)；与AD模型组比较，麦芽醇组明显缩短大鼠寻找平台的时间，搜寻策略也得以改善，由杂乱无章变成趋向式搜寻(P＜0.01)。结果表明麦芽醇能有效改善因AlCl3所致的大鼠空间记忆障碍。（图1）
图1 Morris 水迷宫检测大鼠空间记忆
Con组搜寻平台时间短，搜寻轨迹简单笔直，AD组搜寻平台时间较长，轨迹杂乱无章，MT组与AD组比较，搜寻平台时间缩短，轨迹改善
2.2 免疫印迹检测tau蛋白
3组大鼠总tau（R134d）水平无明显变化。而磷酸化tau（PS396）有明显变化。与对照组比较，AD模型组大鼠PS396显色明显增强（P＜0.01）；与AD模型组比较，麦芽醇组大鼠PS396显色明显减弱（P＜0.01）。结果表明麦芽醇能有效改善因AlCl3所致的tau蛋白过度磷酸化。（图2）
3 讨 论
AD主要的两大神经病特征是大量形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs）及由β?淀粉样多肽（β?amyloid, Aβ）组成的神经细胞间的大量老年斑（senile plaques，SP）。tau蛋白是微管相关蛋白，它的主要功能是促进微管组装、稳定形成的微管、建立细胞的极性、维持神经元细胞内的轴突运输等。在AD中，过度磷酸化的tau蛋白形成成对的双螺旋细丝，从而减弱其结合到微管的亲和力[4]。尽管有实验表明神经元的死亡及认知功能障碍与Aβ的过量产生及tau蛋白的过度磷酸化有关，但是AD患者的临床痴呆程度仅与NFTs的数量密切相关[5～7]。因此减轻tau蛋白的磷酸化水平可能是潜在的防治AD的有效方法。
研究表明麦芽醇可以提高小鼠的抗氧化作用,延缓小鼠红细胞的衰老，对脑缺血再灌注损伤有保护作用[8，9]。
在本研究中，麦芽醇明显缩短大鼠寻找平台的时间，搜寻策略也得以改善，由杂乱无章变成趋向式搜寻，表明剂量麦芽醇能明显改善因AlCl3所致的大鼠空间记忆障碍，对AlCl3所致AD大鼠有治疗作用。在本研究中我们看到麦芽醇能有效改善因AlCl3所致的tau蛋白过度磷酸化，而总tau水平无明显改变。由于tau蛋白的磷酸化水平与NFTs的数量及AD的痴呆程度密切相关。由此我们推测麦芽醇通过在磷酸化水平上对tau蛋白进行调节，抑制tau蛋白过度磷酸化，减少NFTs的数量，从而改善因AlCl3所致的大鼠空间记忆障碍。详细机制还有待进一步研究。
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