结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展
【关键词】 结核病
结核病（tubeiculosis,TB）是一种由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的人兽共患的慢性传染病，可累及全身多种组织器官，其中以肺结核（pulmonary tuberculosis）最为常见。由于MTB耐药株的出现，AIDS合并MTB感染以及全球范围的结核高危人群的流动，造成了TB的全球流行。
化疗是防治TB的主要措施，但由于其疗程较长，费用较高，毒副作用较大，易产生MTB耐药株，这就需要研究更有效的防治措施。卡介苗（BCG）作为预防结核的疫苗，自1921年发现以来一直受到人们的关注。到目前为止，BCG接种人群已达30亿人份。但是经过近一个世纪的研究与应用，发现BCG对结核病的免疫保护力低于80%，对于有免疫缺陷的病人，BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此研制新型有效、安全的结核用疫苗成为国内外学者共同关注的一个重要课题。
分泌性蛋白是MTB生长过程中分泌到胞外的一类蛋白，是目前发现的保护性最好的一组抗原蛋白，对TB的防治具有重要意义。此外，一些存在于细菌细胞壁及细胞质中的蛋白质，也能诱导细胞免疫反应，对结核的感染发挥免疫保护作用。其中分泌性蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的免疫保护性抗原，将成为新疫苗研究的首选靶抗原。现将MTB的保护性抗原的理化性状、生物学特征、免疫学功能等介绍如下。
1 分泌性蛋白
1.1 6KD早期分泌抗原靶（the 6KD early secreted antigenic target , ESAT?6）家族
ESAT?6家族包含有接近100种蛋白，研究较多的主要有ESAT?6、CFP?10和TB10.4，相对分子质量（Mr）6～10KD。
(1) ESAT?6：ESAT?6是一种主要存在于结核杆菌早期培养滤液（ST?CF）中的低Mr蛋白。由RD?1区的Rv3875基因编码，它缺乏传统的信号序列，由ESX?1系统这一替代分泌途径分泌。用SDS?PAGE电泳法测定，结果显示其Mr为6KD，激光解析光谱法测定其Mr为9890±10Da，与依据氨基酸序列推测的理论分子量9975Da极为接近。Sorensen，Harboe等[1，2]用Western blot，Southern blot以及PCR等方法从蛋白及基因水平分析了ESAT?6的分布，ESAT?6基因仅存在于致病性分枝杆菌中，所有BCG菌株（如Tokyo株、Russia株、Sweden株、Moreau株等）及绝大部分环境分支杆菌基因组均丢失该基因，不表达ESAT?6蛋白。ESAT?6在MTB增殖期和非增殖期都高水平地转录[3]，因此，无论是在活动性TB还是在感染潜伏期，ESAT?6均可有效地诱导细胞免疫反应。ESAT?6上有两个CD4+T细胞表位，分别位于N端第1～20位氨基酸和第51～60位氨基酸。实验表明[4～6]，ESAT?6 CD4+T淋巴细胞抗原决定镞可被不同遗传背景的鼠、豚鼠、人及牛的T淋巴细胞识别，产生大量IFN?γ。ESAT?6也可诱发宿主产生特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CD8+CTL），其两个CD8+表位分别位于第21～29和第69～76位氨基酸。Harboe.M [7]等的研究表明，ESAT?6与单克隆抗体HYB76?8反应的表位位于N端第3～15位氨基酸中，与CD4+T细胞的一个表位重叠。
一些研究表明，RD?1介导的毒力与ESAT?6的分泌有关，灭活基因esat?6和cfp?10，或者分泌系统基因，可导致MTB在巨噬细胞内的生长减少及感染鼠模型表位的减少[8～10]。Lalvani[11，12]研究比较了ESAT?6?ELISPOT、PPD?ELISPOT和TST对TB的诊断情况，结果证实了ESAT?6?ELISPOT诊断活动性TB比PPD?ELISPOT和TST的敏感性和特异性均高，且对C?PTB、弥散性结核、肺外结核以及伴有HIV阳性的TB均有很好的诊断效果。Lalvani、Ewer、张灵霞等[12～14]的研究表明以ESAT?6为抗原检测MTB潜伏感染优于TST。
(2) CFP?10：SDS?PAGE分析结果显示其相对分子质量（Mr）在10，000～11，000之间。由RD?1区的基因Rv3874（1hp或esxB）编码，Rv3874位于ESAT?6编码基因Rv3875（esxA）的上游，并与其处于同一操纵子中，一起进行协同转录。Renshaw等[15]研究表明,与ESAT?6的球形蛋白结构不同，CFP?10以天然线性分子形式存在，与ESAT?6形成一紧密的1∶1复合物。荧光显微研究表明，ESAT?6?CFP?10复合物中，CFP?10的C末端与巨噬细胞和单核细胞的特异性结合有关。CFP?10与ESAT?6一样，存在于MTB的ST?CF中，并且与ESAT?6具有同样的分布。与ESAT?6一样，CFP?10与细菌的毒力密切相关，其也能诱发机体特异性Th1免疫应答,在结核的显性与潜伏感染中具有很大的诊断价值[16]。
(3) TB10.4：其基因仅存在于结核杆菌复合体中，能诱导机体产生较强的Th1型免疫应答[17]。
1.2 MPT64蛋白
MPT64蛋白是一种24KD的结核杆菌分泌性蛋白，它具有超氧化物歧化酶活性。其编码基因为RD?2区的Rv1980c。MPT64蛋白主要存在于MTB、牛结核分支杆菌和某些BCG菌株（Tokyo株、Russia株、Sweden株、Moreau株）中，MPT64可诱导肺结核患者的健康人群外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）增殖，并可产生高水平IFN?γ。MPT64具有CD8+T细胞表位，其识别位点是C末端的173～187位氨基酸片段，可诱导小鼠产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T?lymphocytes,CTLs），对结核杆菌的感染具有免疫保护作用。Elhay等[18]的实验发现MPT64可致感染结核的豚鼠产生皮肤DTH反应，而BCG或鸟分支杆菌致敏的豚鼠却不出现皮肤反应。Nakamnra等[19]用皮试检测TB患者和结核菌素阳性健康对照者，其敏感性为87.8%，特异性为100%，化疗少于4个月的结核患者MPT64皮试均阳性，化疗5个月的患者50%皮试阳性，化疗7或8个月的患者皮试均转阴。以上结果表明，MPT64在结核感染的诊断中具有一定的应用价值。
1.3 Ag85复合物
Ag85复合物是由FbpA（Ag85A）、FbpB（Ag85B）、FbpC2（Ag85C）3种纤连结合蛋白形成的异三聚体复合物。Harth等发现结核杆菌Erdman株中3种蛋白的分泌率为2∶3∶1。Ag85A、Ag85B、Ag85C的相对分子量分别为32KD、30KD和31.5KD，分别由fbpA（Rv3804c）、fbpB（Rv1886c）、fbpC2编码。MTB全基因序列的破译，揭示了一个新的基因fbpC1，其转录产物与Ag85成分高度相关（约40%序列相同），由此推测其可能为Ag85复合物中的第四个成分。接下来的研究表明，FbpC1不具备分支菌酸转移酶活性，而分支菌酸转移酶活性是Ag85复合物成分的重要化学特征。研究显示，Ag85复合物及其组分在MTB细胞壁的合成中起着极其重要的作用。Ag85可与细胞表面纤连蛋白（fibronectin,FN）结合，是MTB的FN受体，在分支杆菌黏附细胞的过程中起重要作用，提示其与MTB的致病性有关。在鼠模型上研究BCG对膀胱癌的免疫，发现BCG可与肿瘤细胞表面的FN优先结合，使治疗获得成功。活动性结核病人血清中的Ag85平均水平比其它分支杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍。因此，检测血循环中的Ag85可对活动性结核加以诊断[20]。
Ag85A和Ag85B含多个T淋巴细胞抗原决定镞，可诱导实验动物产生DTH反应和保护性免疫，也可刺激PPD阳性的健康人和活动性结核患者PBMC增殖并产生IFN?γ。Ag85A具有两个CD8+T细胞表位，分别位于N末端的48～56位和242～250位氨基酸片段。Smith等[21]证实Ag85A可刺激PPD阳性的健康人群PBMC分泌IFN?γ。Horwitz等[22]用重组Ag85A或Ag85B免疫豚鼠，可诱导CD8+T细胞免疫应答。Ag85B具有2个T细胞表位，其识别位点分别是N末端的131～155位和233～257位氨基酸片段。Silverf等[23]发现Ag85B可刺激PPD阳性的健康人群PBMC明显增殖并分泌IFN?γ。
Ag85蛋白或DNA疫苗免疫动物后可诱导特异性细胞与体液免疫应答，刺激其产生Th1类细胞因子。因此，Ag85在MTB疫苗的研制中具有很大的应用前景。
1.4 MTB8.4蛋白
MTB8.4蛋白是结核杆菌H37Rv株培养滤液（CF）中纯化分离出的一种低分子量蛋白抗原，因其成熟蛋白分子量为8.4KD而得名。不含信号序列，其编码基因为Rv1174c。能诱导小鼠产生特异性Th1型细胞免疫反应，分泌高水平的IFN?γ[24]。也能诱导PPD阳性者PBMC增殖并分泌IFN?γ。显示其在新型结核疫苗的开发研制中具有非常大的潜力。
1.5 38，000蛋白
38KD蛋白是MTB的主要免疫原，为磷酸盐结合蛋白，参与磷酸盐代谢，是MTB积极分泌的蛋白抗原，其表达量是BCG表达量的10倍，是目前最为常用的TB诊断抗原之一。其编码基因为phos1（Rv0934），在用于结核血清检测时，该蛋白的敏感性和特异性优于其它单一抗原。
2 胞质蛋白
2.1 热休克蛋白（HSP）
HSP是一类在原核和真核细胞中高度保守的蛋白质，从细菌到人体细胞的HSP序列有高度的同源性，正常情况下，HSP参与一些重要的细胞生理活动，如蛋白质转位、折叠和装配，起着分子伴侣的重要作用。当细胞在应激条件如感染、发热、休克、葡萄糖饥饿或细胞恶变时高效表达。这时HSP可作为一重要抗原被免疫系统所识别，因此HSP可在结核的防治中具有一定的应用价值。其中研究较多的有HSP70和HSP65。
TNF HSP70是分枝杆菌中的重要抗原成分，含有至少6个能被多种HLA?DR分子识别的T细胞决定簇，是机体介导免疫反应的靶抗原，可起免疫佐剂作用。研究表明HSP70亦有抗肿瘤作用[25，26]，HSP70可与抗原多肽结合，并将其递呈给机体的免疫细胞以达到抗肿瘤、抗病毒的目的，其在免疫治疗研究中得以广泛应用。
与大多数生物不同的是，MTB基因组携带有两组GroEL基因，即GroEL1和GroEL2，它们分别编码HSP60（cpn60.1）和HSP65（cpn60.2）。HSP60和HSP65在序列上只有61%的同源性，提示它们可能具有不同的功能。HSP65具有20多个T淋巴细胞抗原决定镞，其中1个是MTB和BCG特异性的，该抗原具有很好的免疫保护与免疫治疗作用[27]。MTB HSP60是一种高度保守的细胞内抗原，因此MTB感染会产生针对机体HSP60的交叉免疫反应，可引起实验动物产生自身免疫性疾病。有研究显示[28]，HSP60具有比HSP65更强的细胞因子诱导能力，能使人PBMC产生促炎症反应细胞因子IL?1β、TNFα、IL?6、IL?8、IL?10、IL?12、GM?CSF，而不能刺激产生保护性细胞因子IFN?γ和IL?4。有报道显示[29]，HSP60与分支菌酸的生物合成有关，这对MTB在体内尤其是在巨噬细胞内的生存有重要的意义，基因敲除实验结果也证实了这一点。
2.2 MTB9.9家族
由Rv1793基因编码，是一组由94个氨基酸组成的相对分子质量为9.9KD的蛋白。MTB9.9主要位于细胞裂解液中，在培养滤液（CF）很低，在动物实验中，显示其对结核的感染具有保护效应。83%的PPD阳性者T细胞对重组MTB9.9呈强反应，产生IFN?γ，而PPD阴性者T细胞对其均无反应[30]。
2.3 MTB39α蛋白
由Rv1196基因编码，相对分子质量为39KD，与MTB9.9一样主要存在于细胞裂解液中，培养滤液（CF）中含量很低。R.ALATTIYAH等[31]的研究表明，在TB患者MTB39α蛋白能诱导强烈的抗原特异性PBMC增殖并产生IFN?γ，而在BCG接种健康者中不会，表明MTB39α蛋白可作为一个新的结核疫苗侯选者。
3 膜蛋白
3.1 PPE68蛋白
属PPE68蛋白家族，与ESAT?6、CFP?10一样均属于RD?1区基因产物，由Rv3873编码，含丰富的脯氨酸?甘氨酸重复结构[31]。其存在于MTB细胞膜或细胞壁中，所有BCG中均不存在。PPE68蛋白在实验动物中仅引起较弱的DTH反应。PPE68蛋白可刺激PPD阳性健康者、BCG接种者PBMC分泌高水平IFN?γ，这与PPE家族蛋白同源性很高而引起的交叉反应有关。
3.2 MPB83蛋白
是牛结核分支杆菌细胞表面的糖脂蛋白，由mpb83编码，在不同的牛结核分支杆菌中表达水平不同，BCG Tokyo株和Moreau株是高产株，而BCGDanish1331株为低产株。MPB83蛋白以两种形式存在，一种为26KD脂蛋白形式存在于细胞壁中，另一种为23KD形式存在于培养基中。MPB83是牛结核分支杆菌中的一个重要的B胞抗原靶，其与牛结核分支杆菌的毒力密切相关，在牛结核分支杆菌的血清学检测方面具有一定的应用价值。
随着对MTB保护性抗原的理化性状、生物学特征、免疫学功能等的进一步研究，它们将在TB的防治中具有广阔的应用前景。
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