肿瘤坏死因子α反义寡核苷酸对鼠单疱病毒性视网膜炎的影响
【摘要】 目的 观察不同部位注射肿瘤坏死因子α(TNF?α)反义寡核苷酸对实验性单疱病毒性视网膜炎的影响。方法 BALB/c小鼠右眼前房注射单纯疱疹病毒?1(HSV?1)，同时左眼结膜下或玻璃体注射TNF?α ASON，观察其组织学变化并测定小鼠眼的TNF?α含量，比较2种治疗方式的效果。结果 试验组小鼠眼TNF?α发生视网膜炎的几率及严重度明显减少;玻璃体注射组TNF?α含量更低。结论 采用作用于TNF?α的反义寡核苷酸局部治疗小鼠单疱病毒性视网膜炎,能明显降低感染小鼠眼内细胞因子TNF?α的含量,减轻眼内视网膜炎症反应。结膜下注射给药也许是更好的方法。
【关键词】 视网膜炎;反义寡核苷酸;肿瘤坏死因子;单纯疱疹病毒Ⅰ型
ABSTRACT：Objective To investigate the effect of local treatment with antisense oligonucleotides(ASON)targeting tumor necrosis factor?α(TNF?α)at different positions on experimental herpes simplex virus(HSV)?1 retinitis.Methods After HSV?1(KOS)was injected in the right anterior chamber(AC)in BALB/c mice,the left eyes were treated with TNF?α ASON by subconjunctival or vitreous injection,and the course of contralateral retinitis was evaluated.The ocular TNF?α content was quantified by ELISA.Results In the TNF?α ASON?treated eyes,TNF?α expression and the incidence and severity of retinitis were reduced.The effect of different injection sites was uncertain.Conclusion ASON can reduce TNF?α content and alleviate the inflammatory reaction.Subconjunctival injection may be better.
KEY WORDS：Retinitis;Antisense oligonucleotides;Tumor necrosis factor;Herpes simplex virus?1 葡萄膜炎是眼科的常见疾病之一，其发病机制尚不完全清楚，病理特征是血?房水屏障破坏,蛋白及炎症细胞渗出于血管外以及虹膜睫状体的炎性浸润[1]。近来研究表明肿瘤坏死因子(tumor necrosis facror,TNF)在炎症反应中起重要作用[2]。为了解TNF?α在葡萄膜炎发病机制中的可能作用,我们以反义寡核苷酸(ASON)局部治疗HSV?Ⅰ诱导产生的葡萄膜炎动物模型,并探讨ASON不同注药方式对葡萄膜炎中TNF?α含量的影响。
1 材料与方法
1.1 建立模型
采用BALB/c雌性小鼠，年龄6至8周。动物腹腔麻醉后，右眼前房接种含1×105 菌斑形成单位的HSV?1磷酸盐缓冲液2μl。建立单疱病毒性急性视网膜炎模型。
1.2 试验设计
59只小鼠按随机数字表法随机分为对照组(13只)和试验组(包括结膜下注射组和玻璃体注射组，每组23只)。分别于HSV?1感染前1d、感染后1、4d在手术显微镜下,左眼球结膜下或玻璃体腔注射作用于TNF?α的ASON约5μl。对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液。
1.3 临床与组织学检查
小鼠注射感染后，双目手术显微镜观察小鼠双眼眼部改变如前房炎性反应、瞳孔扩大、虹膜血管扩张以及眼底白色反光等症状。
第8日处死所有小鼠，每组取13只鼠左眼固定、脱水和石蜡包埋。切片成5μm后HE染色。400倍光学显微镜观察在睫状体、视网膜、脉络膜的炎症细胞浸润。按视网膜炎的严重程度从0到2+分级： 0，没有视网膜炎;1+，仅有内1/3的视网膜有炎症细胞浸润，病变累计范围小于1/2视网膜;2+，炎症细胞浸润视网膜全层，病变累计范围大于1/2视网膜。
1.4 脉络膜视网膜中TNF?α含量测定
取结膜下注射组和玻璃体注射组各10只鼠的左眼，打碎离心处理后收集其上清液，采用标准的酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其细胞因子TNF?α的含量。
1.5 统计学处理
不同组TNF?α的含量差异采用t检验方法分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 一般表现
所有HSV?1感染小鼠后,右眼均表现为严重的炎症反应：虹膜血管扩张,前房大量炎性渗出,瞳孔扩大,晶状体混浊。
2.2 组织学观察
感染后第8d，对照组60.0%小鼠左眼观察到严重的急性视网膜炎，视网膜的感光层和外核层破坏，相比之下，组中球结膜下注射组(15.4%)、玻璃体注射组(23.1%)视网膜炎发生率明显降低(P<0.05)，炎症相对集中并仅累及视网膜层的内部三分之一。除含少量的炎性细胞外，视网膜结构仍然保持完整。与对照组(1.6±0.6)比较，试验组视网膜炎严重度评分分别为(0.8±0.4)、(0.9±0.5)，明显降低(P<0.05)。
2.3 试验组中左眼TNF?α含量变化
采用标准ELISA法检测并比较试验组中左眼TNF?α含量变化。结果显示,结膜下注射组TNF?α含量为(10±0.13) pg，玻璃体注射组TNF?α含量为(7±0.11) pg，两组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨 论
葡萄膜炎是临床上常见的一类复发性炎症，目前尚无理想的治疗手段。基础研究和临床观察表明多种细胞因子参与了葡萄膜炎的免疫病理过程，其中, TNF?α在葡萄膜炎发生和过程中的作用尤为关键，TNF?α是一种具有多种功能的炎症和免疫调节细胞因子[2]，在控制病毒复制和与病毒感染有关的免疫病理方面发挥主要作用，通过阻断TNF?α的生成和活性可以抑制视网膜葡萄膜炎的发生和发展。因此抗TNF?α治疗日渐成为葡萄膜炎患者免疫抑制治疗的主要目标[3,4]。基因治疗的应用如单链反义寡核苷酸(ASON)可以杂交互补TNF?α mRNA阻断其翻译[5,6]，能显著降低眼部TNF?α的含量因而减轻局部的炎性反应。使用TNF?α ASON局部治疗可以减少体内的TNF?α并减轻单纯疱疹性角膜基质炎的严重程度[7]。
本组试验中，对侧眼结膜下及玻璃体注射反义寡核苷酸都较好的减少了眼部葡萄膜炎发生率，减轻了葡萄膜炎的病变严重程度。玻璃体注射组与结膜下注射组相比较，TNF?α的含量更低，表明玻璃体注射抑止TNF?α的效果更好，但由于注射针头对眼球的物理性损伤，其抑止炎症的效果并不优于结膜下注射组。结膜下注射ASON可能是抑止炎症反应更好的办法。
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