不同保护剂冻存弓形虫速殖子的观察

【关键词】  保护剂 冻存 弓形虫 速殖子

传统弓形虫保存一般采用小鼠传代法，70年代以来，我国开展了寄生虫低温保存的研究，常用的低温冷冻保护剂有甘油、乙二醇(EG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、经乙基淀粉、二甲基亚砜(DMSO)等。为了观察不同保护剂的效果，我们将弓形虫急性感染小鼠的腹水加入四组不同的低温保护剂后放液氮冻存，进行保种试验观察。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　(1)虫株。弓形虫RH株，南方医科大学寄生虫教研室提供。

　　(2)实验动物与器材。昆明小鼠，雌性，体质量18~22g,南方医科大学实验动物中心提供;液氮罐: YDS?35?125 型(成都液氮容器厂)，液氮冻存管:2ml(NUNC 丹麦)。

　　(3)保护剂。DMSO(上海西唐生物科技有限公司) 、PVP(杭州神华科技)、EG(汕头新宁化工厂)，均为国产分析纯试剂。

　　1.2 虫株冻存方法

　　经传代的昆明小鼠第3天常规方法解剖,腹腔内注射2~3ml生理盐水反复冲洗,收集抽取的腹腔液 (含虫体2×107个/ml) 分别装在2ml的冻存管内,按10%浓度分别加入DMSO 和PVP合剂、DMSO、EG、PVP，然后采用三步法冻存:4℃ 30min，?70℃2h，次日投入液氮中长久保存。

　　1.3 复苏及虫体计数

　　液氮中取出冻存管,在37℃水浴中快速融化.然后滴一滴于血球计数板上，按照公式虫体总数：

　　虫体总数(个/ml)=4个大方格虫体数÷4×104

　　1.4 Giemsa染色

　　取冻存液分别涂片,甲醇固定,用Giemsa染色液染色40min。

　　2 结 果

　　活虫体着色深,结构清,边缘整齐;死亡虫体着色淡,结构不清,边缘裂解,不齐。试验结果见表1。表1 不同冻存液保存弓形虫虫株的结果

　　3 讨 论

　　DMSO分子小，可渗透生物膜，为穿透性保护剂;PVP作为一种高分子，不能穿透生物膜，为非穿透性保护剂，但PVP能减低细胞外溶液的溶质浓度，保持细胞膜内脂质的液晶状态，减少低温对细胞的损害。DMSO与PVP合用对细胞内外均有不同的保护作用，过去很少有人报道合用冻存剂，本实验应用DMSO与PVP合剂冻存弓形虫，效果最佳。

　　用EG作为保护剂冻存的效果最差。EG常温下有毒性，EG做保护剂的样本，在解冻后得用生理盐水反复冲洗，否则注入小鼠腹腔后，小鼠1min内抽搐死亡。

　　在弓形虫冻存中，通常采用慢冻速融法效果最好。慢冻法是将冻存标本分别于4℃~70℃之间预冻，然后投入液氮中。快融即整个溶解过程控制在1min内，从液氮中取出样本后迅速投入37℃的温水浴中，要注意样品的四周均匀地在恒定的温度中迅速融解，避免激烈震动。

　　弓形虫低温保存的效果还取决于冻存时弓形虫速殖子的状态。一般选择健康的小鼠接种，体质量为18~22g，在感染3d收集小鼠腹水，此时弓形虫状态最佳。