丹参酮IIA对大鼠肺缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

【摘要】  目的 研究丹参酮IIA对大鼠肺缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡以及相关蛋白表达的干预作用。方法 健康SD大鼠60只随机分成四组，除对照组外，均建立肺缺血再灌注模型，其中两组分别加丹参酮IIA和生理盐水干预，检测肺组织湿/干重比、细胞凋亡率、Bcl?2及Caspase?3的表达等指标。结果 肺缺血再灌注组与对照组相比，肺组织湿/干重比明显增高，流式细胞仪检测出现大量的凋亡细胞，证明该模型制备是成功的;肺缺血再灌注组显示有统计学意义的凋亡，Bcl?2降低和Caspase?3增高与对照组比较有统计学意义;丹参酮组与未干预组和生理盐水组比较，Bcl?2增高和Caspase?3降低均有统计学意义。结论 丹参酮能够改善由肺缺血再灌注引起的细胞凋亡，其机制可能与丹参酮能干预肺组织Bcl?2和Caspase?3蛋白的表达有关。

【关键词】  肺;缺血再灌注;凋亡;Bcl?2;Caspase?3;丹参酮

　　ABSTRACT：Objective To investigate the effects of Tanshinone on apoptosis and the related proteins during lung ischemia reperfusion injury(LIRI) of rats.Methods Sixty rats were randomly divided into four groups.Apoptotic cells in lung tissue was inspected by flow cytometry and Hematoxylin and Eosin staining,and the expression of Bcl?2 and caspase?3 was detected by RT?PCR and western blot.Results Compared with normal control group,apoptotic cells and the expression of Bcl?2 and Caspase?3 in LIRI model group were markedly increased(P<0.01).Compared with model group,tanshinone could significantly inhibite cell apoptosis and the expression of apoptosis?related proteins in lung tissues(P<0.05).Conclusion Tanshinone can protect lung from ischemia reperfusion injury by modulating the expression of apoptosis?related proteins Bcl?2 and Caspase?3.

　　KEY WORDS:Lung;Ischemia referfysion injury;Apoptosis;Bcl?2;Caspase?3;Tanshinone

　　肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury，LIRI)过程中细胞凋亡过度是导致肺损伤的重要原因之一，凋亡作为LIRI的早期事件，参与了LIRI的病理生理过程[1,2]。丹参酮IIA因其具有毒副作用小、“多靶效应”等特点而广泛应用于临床，尤其在防治缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤方面，具有明显的保护作用[3]。本实验首先建立大鼠肺IR模型，然后观察丹参酮IIA对LIRI后肺组织Bcl?2、Caspase?3表达和细胞凋亡的影响，探讨丹参酮IIA对LIRI中细胞凋亡的保护作用及其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组

　　成年雄性健康SD大鼠(湖北省实验动物中心提供)60只，体质量300±25g。随机分为正常对照组(A组，n=6)，除不作缺血处理外，余同其它组;肺缺血再灌注组(B组，n=18);缺血再灌注加生理盐水组(C组，n=18)，腹腔注射生理盐水，缺血1h，再灌3h;肺缺血再灌注加丹参酮组(D组，n=18)，腹腔注射丹参酮，剂量为15mg/kg,缺血1h，再灌3h。B、C、D每组又分为三个亚组，再灌时间分别为1h、2h、3h，每个亚组6只大鼠。

　　1.2 大鼠肺缺血再灌注模型的建立

　　实验模型的制备采用Eppinger方法，Sekido等模型[4]。取健康SD大鼠，20%水合氯醛(300～350)mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧位固定。行颈部正中切口，分离出气管、右侧颈静脉和颈动脉，气管切开、插管，接动物呼吸机行机械通气(吸入室内空气，呼吸频率40次，潮气量10ml/kg，吸呼比为1∶2)，右侧颈静脉插管、固定，接微量注射泵;然后经左侧第5肋间开胸，游离左肺门，静脉注射肝素100U。静息5min后，于呼气末用无创血管夹阻断左主支气管、左肺动脉和左肺静脉。1h后开放，进行再灌注1h、2h、3h。

　　1.3 标本制备及检测指标

　　在缺血和再灌注的不同时间点取左肺组织，立即冻存于液氮中备用。自液氮中取出组织样品，检测肺组织湿/干重比、细胞凋亡率、Bcl?2及Caspase?3的表达等指标。肺组织细胞凋亡率用流式细胞仪检测;Bcl?2的表达采用Western Blot方法检测(武汉晶美Western Blot试剂盒);Caspase?3的表达采用PCR方法检测。

　　1.4 统计学分析

　　实验数据以均数±标准差记录，采用SPSS13.0统计软件包行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组肺组织W/D

　　与A组比较，B组W/D在1h亚组即有升高，2h达到高峰，第3h组下降;与B组比较，C组没有统计学意义的差异;与B、C组比较，D组W/D的表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01);与A组比较，D组没有统计学意义的差异。(表1)表1 各组大鼠肺组织W/D比较与A组比较,*P<0.01;与D组比较,△P<0.01

　　2.2 肺组织细胞凋亡率

　　流式细胞仪检测结果B、C组2h肺组织细胞凋亡率分别为30.5%±2.3%、35.0%±7.7%，3h肺组织细胞凋亡率分别为22.1%±1.2%、20.3%±1.3%，其余组别都不超过5.0%(图1)。B组肺组织2h和3h组细胞凋亡率分别较A组增高(P<0.01,P<0.05)，而C组较B组无统计学差异，但仍与A组有显著差异(P<0.01,P<0.05)，D组肺组织细胞凋亡率3h点较2h点有所降低(P<0.05)，与A组无显著性差异。

　　2.3 LIRI后肺组织Bcl?2的表达

　　A组大鼠肺细胞无凋亡，Bcl?2高表达。与A组比较，B组Bcl?2在LIRI后1h表达降低，2h达到低峰，3h升高;与B组比较，C组没有统计学意义的差异;与B、C组比较，D组Bcl?2的表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01);与A组比较，D组没有统计学意义的差异。(表2) 表2 各组大鼠肺Bcl?2蛋白表达

　　2.4 LIRI后肺组织Caspase?3的表达

　　A组大鼠肺细胞无凋亡，Caspase?3蛋白低表达。与A组比较，B组Caspase?3的活化表达在1h亚组即有升高，2h达到高峰，第3h大致正常;与C组比较，B组没有统计学意义的差异;与B、C组比较，D组Caspase?3的表达下降，差异具有统计学意义(P<0.01);与A组比较，D组没有统计学意义的差异。(表3)表3 各组大鼠肺Caspase?3蛋白表达

　　3 讨 论

　　LIRI可在多种临床情况下发生，包括心肺转流、肺栓塞与肺移植等。自从Cooper等于1983年报道了首例成功的肺移植至今，对于囊性纤维病、肺气肿、原发性肺动脉高压、特发性肺纤维样变等终末期肺病，肺移植已经成为一种标准方法。与其他器官移植一样，肺移植中同样存在移植肺的保存、缺血再灌注、术后感染、急慢性排斥反应等，使其在临床实践中仍受到极大限制。LIRI在20%的肺移植患者中导致致死性的移植物功能不全。LIRI能促进供肺移植后再灌早期肺组织细胞凋亡，过度的凋亡可导致肺功能受损。

　　细胞凋亡是在一定的生理病理条件下，为维持内环境稳定或者器官组织构建的需要，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。研究表明，细胞凋亡受一系列基因的调控，其中Bcl?2基因是与LIRI后细胞凋亡关系最密切的凋亡调控基因之一。Bcl?2即B细胞淋巴瘤/白血病?2基因，是第一个被确认的有抑制凋亡作用的基因[5]。Caspase?3(CPP32)处于被认为是蛋白级联切割过程的凋亡核心位置，起着很重要的作用，称为死亡蛋白酶[6]。

　　肺组织的湿/干重比可间接反映肺内漏出液体量的变化，漏出液越多，肺湿/干重比越高，同时灌洗液的回收率也越高。本研究表明，LIRI组大鼠在湿/干重比较对照组明显增高，结合肺组织中Bcl?2、Caspase?3蛋白变化可以发现大鼠LIRI后由于凋亡导致W/D结果存在统计学意义的差异，而丹参酮治疗LIRI可以从调节凋亡Bcl?2、Caspase?3蛋白的表达而得到解释。

　　肺组织凋亡率可直接反映肺组织细胞凋亡情况，从流式细胞仪检测来看，细胞凋亡在LIRI过程中起到重要作用，并且为丹参酮抑制细胞凋亡从而改善LIRI提供了有力的实验佐证。

　　本实验流式细胞仪检测结果证实细胞凋亡在LIRI中扮演重要角色，同时也证明了模型的成功。对照组大鼠肺细胞无凋亡，Caspase?3蛋白无表达。LIRI后1h肺凋亡细胞增多，2h明显增多，3h下降。Bcl?2在LIRI后1h表达下降，2h达到低峰，3h升高。Caspase?3蛋白在LIRI后1h表达增加，第2h达到高峰，3h下降。生理盐水干预未见与B组明显差异，使用丹参酮IIA干预细胞凋亡在2h明显减轻，与正常对照组未见明显差异。

　　具有抑制凋亡的Bcl?2蛋白在A、D两组表达最高，B、C组出现凋亡时降到最低，证实了在LIRI过程中凋亡起着重要作用及丹参酮在治疗过程中与凋亡相关基因蛋白表达变化是其重要凋亡传导环节。类似地，Caspase?3是凋亡线粒体途径的重要交接点，在本实验中，PCR方法说明Caspase?3在A、D两组最低，B、C组出现凋亡时升到最高，这与上述凋亡理论相吻合。

　　综上所述，无论从W/D、流式细胞仪检测、凋亡及其相关蛋白Bcl?2和Cspase?3的研究都协同证实了LIRI模型的成功，并且证实了细胞凋亡是其过程中的重要机制，而丹参酮通过上调Bcl?2的表达和下调Cspase?3的表达，抑制LIRI后肺组织细胞的凋亡，从而改善LIRI。

【】
  　　[1]Cobelens PM，Putte BP，Kavelaars A，et al. Inflammatory consequences of lung ischemia?reperfusion injury and low?pressure ventilation[J].J Surg Res，2008，32(8?10)：1086

　　[2]Fournié GJ，Courtin JP，Laval F.Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigations in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumours[J].Cancer Lett，1995，91(2)：221

　　[3]甄胜西，王永剑，张本固.丹参酮对离体肺的保护作用研究[J].基层医药，2004，11(8)：926

　　[4]王永剑，张本固.丹参酮在离体肺保护中应用的实验研究[J].江西医学院学报，2006，46(3)：7

　　[5]Park SE,Kim SH,Hossain MA.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells[J].J Ethnopharmacol,2008,7(11):3586

　　[6]Sitailo LA,Jerome?Morais A,Denning MF.Mcl?1 functions as major epidermal survival protein required for proper keratinocyte differentiation[J].J Invest Dermato,2008,66(19):9636