人生长激素结合蛋白的结构及功能
【关键词】 人 生长激素 结合蛋白
随着医学界对人生长激素(human gowth hormone，hGH)促生长、发育等生理机制研究的深入，生长激素?胰岛素样生长因子(insulin?like growth factor，IGF)轴的功能、机制也越来越被人们所重视。现已证实，GH在体内的生理功能主要是通过结合人生长激素受体(human growth hormone receport，hGHR)，受体二聚后启动信号转导来完成。但还涉及到与人生长激素结合蛋白(human growth hormone binding protein，hGHBP)的功能联系，则需进一步探讨。hGHBP由hGHR胞外段经蛋白水解酶水解获得[1，2]。其确切的生理功能还不十分清楚，一般认为它主要是与hGH结合，延长hGH半衰期，降低GH的体内清除率[3]。而越来越多的研究表明它与GH、GHR间的功能联系紧密，除了能够调节GH的生物活性外，还可能参与调节GHR基因的表达和转录，核内信号转导等[4]。本文就hGHBP的形成、结构及功能等方面做一综述。
1 人生长激素受体
已获人、兔、小鼠、大鼠、羊、牛、猪、鸽子、猴等共十几个种属GH受体cDNA克隆。人GHRcDNA共编码638个氨基酸，其中包括一个由18个氨基酸组成的信号肽。成熟的人GHR分子是一个含620个氨基酸的单链糖蛋白，其中N端246个氨基酸含5个潜在的糖基化位点，位于细胞外，构成激素结合结构域;第247?270为强疏水性氨基酸构成的跨膜区;C端350个氨基酸位于胞内，构成信号转导域[5]。与INS、PDGF等生长因子受体不同的是其胞内区不具有内在的Tyr蛋白激酶活性。基于cDNA推导的氨基酸序列，GHR分子量应为70KD，但事实上共价交连技术所证实的人IM?9淋巴细胞表面GHR分子量为104KD，人肝细胞表面GHR分子量为124KD，这种表观分子量上的差异是由N?糖基化和泛肽引起的[6]。
2 人生长激素结合蛋白
在动物的血浆中，许多激素都具有特异的、高亲和力的结合蛋白。迄今人们已阐明了甲状腺素、类固醇激素、肽类激素等的特异结合蛋白。早在上世纪六十年代初就有人推测GH在血浆中有其蛋白质的结合形式，但直到1986年，美国的Baumann等[7]首先证实了动物血浆中存在GH的特异性结合蛋白。他们发现，125I标记的hGH在血中可同蛋白质特异的结合在一起。
2.1 人生长激素结合蛋白的产生
hGHBP是由人GHR胞外段经特异蛋白水解酶剪切获得。已发现整合到细胞膜上的肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)是这种剪切作用中很重要的一种酶[1，2]，转染了兔GHR并敲除TACE酶基因小鼠的纤维母细胞失去了产生可溶性GHBP的能力。TACE是一种整合到细胞膜上的金属蛋白水解酶(ADAMs)。它的酶解依赖锌离子的作用。一些活性因子(如血小板生长因子)也对GHBP产生有一定的作用。但GHBP产生的分子调节机制未完全清楚。有学者发现GH诱导的受体二聚后能减缓受体外段蛋白的水解。另一方面GH的存在对TACE酶与GHR之间的作用又必不可少[2]。
2.2 人生长激素结合蛋白种类、结构
根据GHBP与GH的亲和性不同可分为两类：一种是对热不稳定，高亲和力，低容量的GHBP(high?affinity growth hormone binding protein，HGHBP)，是由Baumann和Herington两个研究小组独立发现。HGHBP是单链的酸性糖蛋白，分子量为61KD，等电点为5.0，经凝胶层析和亲和层析纯化，用凝胶过滤，SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹所测定的分子量均接近来61KD，与一个GH分子结合形成的复合物为85KD。它与GH结合的亲和常数为3.9×10?9M，结合容量为0.9nM。GHBP的多肽链骨架由246个氨基酸残基组成，只占整个分子量的一半左右，另一半则是糖基化成分。有资料证实，糖基化成分并非为GHBP功能所需，GHBP在人血清中约为1nM浓度。GHBP与GHR的关系很大，人GHBP具有同GHR胞外相似的结构和生物免疫活性，在家兔证明GHBP与细胞外GHR氨基酸顺序一致。高亲和性GHBP与22KD的GH有特异性的结合。高亲和性GHBP分子折叠成两个结构极其相近的功能域，每个功能域都由两个反向平行的β片层组成，β片层结构则分别由3个和4个肽链段构成，位于氨基末端的功能域由第1到第123位氨基酸残基组成，是GHBP的结合域，其中有3个二硫键对维持其结合功能至关重要[8]。据报道，结合部位很可能在二硫键富集区。位于羧基末端的功能域由第128到238位氨基酸残基组成，是GHBP?GH复合物中两个GHBP分子相互连接的部位。1991年Cumningh等[8]用定点空变法证明2个GHR分子共同结合着一个分子的GH。在GHR?GH复合物中，2个GHR分子以与GH中心轴相垂直的平面为界，呈现镜影对称关系。
另一种分子为低亲和力，高结合容量、对热稳定的GHBP(low?affinity growth hormone binding protein，LGHBP)，分子量为100KD，pI为7.0，对GH亲和常数约为10?5M[4]。一分子GH结合一分子的LGHBP，它同HGHBP和GHR无结构相关性，而表现出对20KDGH的结合特异性。
人血浆中GHBP水平几乎无性别差异，也无昼夜节律波动，但是个体间的差异很大。在生长发育过程中，以胎儿和新生儿期的GHBP水平最低，幼儿期急剧升高，青春期后又逐渐降低，成年后基本维持在相当恒定的水平。Maheswari等[9]研究发现末梢淋巴中GHBP的浓度比股动脉或静脉约低3倍，认为GHBP不能轻易通过脉管系统扩散。
3 GHBP的生物学作用
GHBP的确切功能和对GH生物活性的影响还未完全清楚。理论和分子模拟分析认为GHBP和GH结合呈1∶1的比例，只有当超生理浓度的GHBP存在时会出现2∶1的结合[10]。GH的主要生物学作用为调节躯体和组织的生长、发育。在生理浓度范围内，对体内碳水化合物及脂肪代谢有明显作用。GH作用有赖于血浆GH浓度、分泌形式、到达血管外间隙和靶细胞的途径，以及细胞表面受体的数目和亲和力等。GHBP与GH结合，可在上述几个环节影响GH对靶细胞的作用，从而调节GH的转运、代谢以及生物活性的发挥。除此外，GHBP还可能参与调节GHR基因的转录，以及核内信号转导等。
3.1 调节循环血中GH的水平
一般认为GHBP是一种GH活性调节剂。调节游离GH和结合GH之间的比例，延长GH的生物半衰期。Baumann等[1]人指出，GHBP与GH所形成的共价复合物比游离GH的代谢廓清率要低10倍。在人类血浆中，GHBP结合着约一半以上的GH，其结合速率很快，当脑垂体出现GH分泌高峰后，仅需数分钟即可完全结合，避免了GH水平的过度升高。与GHBP结合的和游离的GH处于动态平衡之中。当GH的分泌处于低谷时，GHBP又释放出GH，这样，抵消了由于脑垂体分泌活动的节律性变化而产生的GH振荡，有利于GH在血浆中维持一个较为恒定的生理浓度。因此，GHBP在正常的生长发育过程中可能起着重要的生理作用。
GH是通过肾小球滤出和经受体介导内吞入胞后降解两个途径而清除的。由于GH和GHBP结合后形成的复合物不能从肾小球滤出，同时GHBP可阻断GH与其受体的结合，减少GH的入胞和随后的降解，所以它使GH的血浆清除降低10倍左右。最近的报道认为游离GH的半衰期为7min，与GHBP结合后则延长到27min[11]。血循环中大部分GH与GHBP相结合运输到各组织。Baumann等人将125I?hGH与GHBP共价连接后进行实验，发现结合GHBP的125I?hGH仅局限于较小的分布体积(约为血管内间隙的2倍)，而游离125I?hGH可分布于整个细胞外室。由于GHBP的广泛分布以及可由肝外组织产生，所以其可能在局部与GH相互作用并对GH起局部调节作用。因此，GHBP在GH运输过程中，不仅是一种运输载体，而且还是GH作用的局部调节物质。
3.2 GHBP对GH的影响
GHBP的结合域与GHR的膜外域是一致的，它们对GH的亲和力又相同，所以GHBP对GHR与GH的结合具有竞争抑制作用。正常个体血浆中大约有30%～50%循环GH与GHBP相结合[12]。由于GH分子可以同时与两分子的GHR膜外域的GHBP结合，这对GHR来说可引起二聚体的形成，从而启动信号系统，使GH的生理作用得以发挥。可是在GHBP存在条件下，GH的一个结合位点可被GHBP占据，阻碍受体二聚体的形成，进而影响GH作用的发挥。离体实验已证实[13]，GHBP能抑制GH的生物效应，包括GH与GHR的结合、GH的脂解作用、细胞增生、IGF?1的生成等。提纯的GHBP或血清中GHBP可阻止GH与人IM?9细胞、人肝细胞、大鼠肝细胞以及大鼠脂肪细胞上的GHR相结合，进而阻止GH生物活性的发挥。Asada等[14]指出，GHBP可阻止GH介导的前脂肪细胞转化为脂肪细胞，减少GH与GHR的结合。另外，GHBP对GH刺激人体成纤维细胞内IGF?1的生成以及增生方面也具有抑制作用。
3.3 GHBP对GHR的影响
从人肝细胞瘤系细胞的离体研究表明GHBP浓度与GHR基因转录呈现双向关系：低浓度(50pM)时，GHR基因转录增加;高浓度(500pM)时，GHR基因表达减少[15]。当GH在生理浓度范围时，能增加GHR基因的表达;而超过生理浓度时，会减少GHR的表达同时增加GHBP的产生。类似的人肾小球囊细胞系研究同样验证生理浓度的GH能刺激GHR基因表达，而且能剂量依赖性增加GH的结合活性，但B2036?PEG(pegvisomant，培维索孟)消除GH对GHR基因表达影响的同时也能阻止GHBP的产生[4]。这些研究说明GHBP的产生或体内水平并不能直接反映GHR mRNA的水平。
3.4 GHBP在跨膜传递中的作用
GHBP在体内的分布极为广泛，它不仅存在于组织液(包括血液)，而且在胞浆和细胞核中也发现有GHBP的存在。据推测，血循环中的GHBP主要来源于肝脏，对于GH的运输和游离GH水平的稳定性具有肯定作用;而其它组织细胞所产生的GHBP主要存在于细胞间隙和细胞内，调节GH作用的正常发挥。尽管大量的实验证据表明GH的多生理功能效应是经由胞内可溶性Tyr激酶Jak2介导的。但近年来许多实验支持GH核信号途径假说：GH结合膜表面受体，之后GH?R复合物经细胞内吞越过胞质进入核内直接发挥作用。免疫组化实验显示大鼠和兔组织细胞核膜、核基质中均存在GHBP;核抽提物Scatchard分析揭示兔、大鼠肝细胞以及CHO?GHR(1?638)细胞的核膜、核基质、染色质组分均含有高亲和性的GH结合位点，研究显示这种结合蛋白的分子量约为67KD，与血清GHBP相当。Lobie等[16]应用定量的显微镜放射自显影术研究静脉注射125I?hGH的大鼠细胞，发现GH和GHR的核转位现象。但这一现象产生的生理意义尚待进一步研究，GHBP也许可以直接与GH应答基因(Spi2.1、fos、IGF?1)的启动子元件发生作用[17]，产生系列生物效应。
分子识别作用是所有生物过程的一个基本特点。受体?配体和抗体?抗原的相互反应就是这种分子识别的范例。细胞表面受体与配体结合的过程在细胞信息交流中起着重要的作用。GHR是一种单通道受体，具有三个独特的区域，即与配体结合的细胞外区、跨膜多肽区和对受体激活产生应答或称“第二信使”的细胞内区。人GHR的外区，在血清中可以激素?结合蛋白的形式存在，这在激素清除的调节中起着重要的作用。GHBP既能提高也能抑制GH的生物效应。它能延长GH的半衰期，但同时能阻止GH与其受体的结合。它对GHR基因的各种影响也因浓度不同而异，探讨GH、GHR、GHBP三者之间的关系及功能将有利于GH?IGF?1研究领域的。
【】
[1]Y Zhang, J Jiang,Black RA,et al.Tumor necrosis factor?alpha converting enzyme (TACE) is a growth hormone binding protein (GHBP) sheddase: the metalloprotease TACE/ADAM?17 is critical for (PMA?induced) GH receptor proteolysis and GHBP generation[J].Endocrinology,2000,141: 4342
[2]Schantl JA,Roza M,Kerkhof P,et al.The growth hormone receptor interacts with its sheddase,the tumour necrosis factor?alpha?converting enzyme (TACE)[J].Biochem,2004,377(2):379
[3]Greenstein J,Guest S,Tan JC,et al.Circulating growth hormone binding protein levels and mononuclear cell growth hormone receptor expression in uremia[J].Ren Nutr,2006,16 (2):141
[4]Meinhardt U,Eble A,Besson A,et al.Regulation of growth?hormone?receptor gene expression by growth hormone and pegvisomant in human mesangial cells[J].Kidney Int,2003,64: 421
[5]Frank SJ.Growth hormone signalling and its regulation:preventing too much of a good thing[J].Growth Horm IGF Res, 2001,11: 201
[6]Ballesteros M,Leung KC,Ross RJ,et al.Distribution and abundance of messenger ribonucleic acid for growth hormone receptor isoforms in human tissues[J].Clin Endocrinol Metab,2000,85: 2865
[7]Fisker S. Physiology and pathophysiology of growth hormone?binding protein: Methodological review and clinical aspects[J].Growth Horm IGF Res,2006,16 (1): 1
[8]Cunninghan BC,Ultsch M,De?Vos AM,et al. Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule[J].Science,1991，254: 821
[9]Maheshwari H,Lillioja S,Castillo CE,et al. Growth hormone?binding protein in human lymph[J].Clin Endocrinol Metab,1995，80: 3582
[10]Hocquette JF,Postel?Vinay MC,Djiane J,et al. Human liver growth hormone receptor and plasma binding protein: characterization and partial purification[J]. Endocrinology,1990，127: 1665
[11]Amit T,Hartmann K,Shoshany G,et al. The turnover of growth hormone (GH)?binding protein and GH receptor in rabbit and rat[J].Mol Cell Endocrinol,1993,94:149
[12]Veldhuis JD,Johnson ML,Faunt LM,et al. Influence of the high?affinity growth hormone (GH)?binding protein on plasma profiles of free and bound GH and on the apparent half?life of GH. Modeling analysis and clinical applications[J].Clin Invest,1993，91:629
[13]Wada M,Uchida H,Ikeda M,et al. The 20?kilodalton (kDa) human growth hormone (hGH) differs from the 22?kDa hGH in the complex formation with cell surface hGH receptor and hGH?binding protein circulating in human plasma[J]. Mol Endocrinol,1998，12:146
[14]Asada N,Takahashi Y,Honjo M,et al. Effects of 22K or 20K human growth hormone on lipolysis, leptin production in adipocytes in the presence and absence of human growth hormone binding protein[J].Horm Res,2000，54:203
[15]Mullis PE,Eble A,Wagner JK,et al. Effect of different serum concentrations of growth hormone binding protein (GHBP) on the regulation of GH receptor/GHBP gene transcription in a human hepatoma cellline[J].Horm Res,1997，47: 73
[16]Lobie PE, Wood TJ, Chen CM,et al. Nuclear translocation and anchorage of the growth hormone receptor[J].Biol Chem Dec,1994，269 (50): 31735
[17]Mertani HC, Raccurt M, Abbate A,et al. Nuclear translocation and retention of growth hormone[J]. Endocrinology,2003，144(7): 3182
