Survivin、Bcl?2在I期NSCLC中的表达及其临床意义

【摘要】  目的 手术后I期非小细胞肺癌的预后情况与众多因素有关，凋亡相关基因在肿瘤的发生过程中发挥重要的作用。本研究通过检测凋亡相关基因Survivin及Bcl?2在I期非小细胞肺癌中的表达情况，探讨其在I期非小细胞肺癌的临床意义和预后价值。方法 利用免疫组化学技术检测85例I期非小细胞肺癌（NSCLC）及20例肺良性肺组织中Survivin和Bcl?2的表达，统计分析这两者在I期非小细胞肺癌的作用。结果 85例I期非小细胞肺癌组织中Survivin和Bcl?2的表达率分别为64.7% (55/85) 和52.9％（45/85）与正常肺组织中的表达差异显著（P<0.05）；多因素分析显示 PTNM分期与Survivin蛋白的阳性表达是I期非小细胞肺癌患者独立预后因素（P<0.01），Survivin、Bcl?2蛋白的表达与临床、病理各因数无相关。结论 在I期非小细胞肺癌中，凋亡相关基因Survivin及Bcl?2可能对肿瘤的发展与预后产生一定的作用与影响；PTNM分期与Survivin蛋白的阳性表达是此Ⅰ期非小细胞肺癌术后患者的独立预后因素。

【关键词】  肺肿瘤；癌；非小细胞性；Survivin；Bcl?2

    ABSTRACT：Objective To investigate the expression of the representative apoptosis?related oncogene survivin and Bcl?2 in stage I non?small cell lung cancer and its clinical value.Methods The expression of survivin and Bcl?2 was detected by using Labelled Streptavidin Biotin immunohistochemistry assay in 85 NSCLC stage I surgical specimens and 20 benign disease specimens. Results The positive rates of survivin and Bcl?2 were 64.7% (55/85) and 52.9％（45/85）, respectively, there was significant difference between tumour and non?tumour (P <0.05). PTNM stage and positive expression of survivin were  independent prognostic factors of stage I NSCLC . Conclusion In stage I NSCLC, apoptosis?related oncogene may be important to the occurrence and development of lung cancer; PTNM stage and positive expression of survivin are independent prognostic factors .

    KEY WORDS：Lung neoplasms；Cancer；Non?small cell; Survivin;Bcl?2

    细胞凋亡是一种由凋亡相关基因调控的细胞自身程序化死亡（programmed cell death，PCD）。肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关,也与细胞凋亡的异常密切相关。本研究拟分析凋亡相关基因Survivin和Bcl?2在I期非小细胞肺癌的表达及临床意义，研究两者对I期NSCLC术后患者的指导意义及预后价值。

    1  资料与方法

    1．1  标本

    本研究收集1997年6月至1999年6月肺癌根治术后85例I期非小细胞肺癌患者术后标本，无其他部位原发肿瘤，术前未接受放化疗，死亡原因明确。其中男45例（52.9%）,女40例(47.1%)；年龄24～78岁,中位年龄55岁。根据WHO分型标准，腺癌39例，鳞癌33例，腺鳞癌11例，大细胞癌2例 。另收集1997年6月至1999年6月手术切除的肺非肿瘤组织20例，结核8例，正常肺组织12例，男13例，女7例，年龄36～75岁，中位年龄49岁。根据国际抗癌联盟（UICC）97 TNM病理分期标准。所有组织(肺肿瘤组织与非肿瘤肺组织)均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片。

    1．2  临床病理资料收集

    回顾性收集85例患者的年龄、性别、病理类型、临床分期等资料，所有病例随访完全，生存时间按月。

    1．3  试剂与方法

    Survivin和Bcl?2抗体由北京中山公司提供，SP9000试剂盒由北京中山公司提供。采用LSAB法。将石蜡标本以5μm层厚切片，烤干，于二甲苯液中脱蜡，不同浓度的乙醇中脱水，3％的H2O2溶液消除内源性过氧化物酶的活性，EDTA（PH 8.0）修复液常规修复，玻片封闭，孵育盒中抗体孵育，抗原暴露，加入山羊血清，依次滴加一抗、二抗、三抗，DBA显色，苏木精复染，烘干封片。（Survivin的抗体工作浓度为1:100，PBS液代替一抗、二抗作为阴性对照）。

    1. 4  结果判断

    Survivin染色结果评估采用综合计分法，细胞染色强度分为3 级:1：浅黄色为弱阳性(+), 2：中度阳性(++), 3:阳性(+++)。在400×光镜下随机观察5 个不同视野,根据阳性细胞占总细胞数的百分率分为5个等级:0 级,<5.0%:1 级,5.0%～25.0%;2 级,26.0%～50.0%:3级,51.0%～75.0%和4 级,>75%。用细胞数分级和强度分级的乘积作为判断Survivin的表达结果,若乘积≤1 为阴性,反之则为阳性；Bcl?2染色结果评估采用在400倍光镜下随机观察5个不同视野，着色细胞数≥10％判断为阳性，＜10％判断为阴性。免疫组化结果由两位病理医师盲法读片得出。

    1．5  统计分析

    采用SPSS10.0软件包进行统计学分析，Survivin、Bcl?2在NSCLC及肺良性肿瘤中的表达差异采用χ2检验，应用COX风险回归模型进行多因素分析，Survivin、Bcl?2在肺癌组织中表达与各临床、病理因数的相关性采用χ2检验，统计中将P<0.05视为有统计学意义。

    2  结  果

    2．1  Survivin、Bcl?2蛋白在肺癌组织与非肿瘤组织中的表达

    Survivin、Bcl?2蛋白在肺癌组织中的表达率分别为64.7%（55/85）和52.9%（44/85），肺非肿瘤组织中的表达率分别为10.0%（2/20）和15.0%（3/20），可见两组表达率有非常显著性差异（P＜0.05）。Survivin阳性表达呈点状，主要定位在细胞浆，呈棕黄色，胞核未见染色（图1），Bcl?2蛋白阳性表达定位在细胞浆，呈棕黄色颗粒状，胞核未见染色(图2)。

    2．2  多因素分析

    将性别（分为男性及女性组）、血型（分为B型与非B型组）、PTNM分期（分为IA和IB期组）、病理类型（分为鳞癌和非鳞癌组）、年龄（分为＜60岁和≥60岁组），Bcl?2（分为阳性与阴性组）、Survivin（分为阳性与阴性组），引入Cox比例风险模型进行多因素分析，结果Survivin蛋白表达的情况、PTNM分期为早期非小细胞肺癌的独立的预后因素，见表1。 表1  影响I期非小细胞肺癌术后患者5年生存率的多因素分析

    2．3  Survivin、Bcl?2与临床、病理指标的相关性研究（见表2） 表2  Survivin、Bcl?2、临床、病理各因素相关性

    3  讨  论

    细胞的凋亡调控存在多方面因素，越来越多的与凋亡相关的基因被发现，除了原有发现的Bcl?2家族等凋亡调控机制外,Survivin是发现不久的凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein）家族成员之一。

    Survivin的抗凋亡作用独立于Bcl?2家族，它具有较特异的抗凋亡效应通道，其对caspase?3和/或caspase?7有直接/或间接的作用，众所周知，在细胞的凋亡过程中，各种不同的凋亡信号最终是通过凋亡效应蛋白酶（caspase）实现的，survivin是特异与效应蛋白酶级联反应中的关键分子caspase?3和caspase?7相结合，从而抑制多种凋亡刺激信号的作用。Bcl?2则通过广泛的抑制各种刺激诱导的细胞凋亡，延长细胞的生存。Survivin基因见于胚胎组织，而在成人仅见于胸腺组织与子宫内膜，大多数的正常组织均测不到Survivin基因的表达,研究[1?3]表明：Survivin蛋白在结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤中都有一定的表达。本研究亦发现在I期非小细胞肺癌组织中，Survivin 与Bcl?2的表达率分别为64.7％和52.9％明显高于非肿瘤组织的10.0％和15.0%，差异明显（P <0.05)，这种明显的表达上调提示在早期非小细胞肺癌组织中就存在凋亡抑制基因作用增强，可能与肿瘤的发生关系密切。

    现有的针对Survivin及Bcl?2在非小细胞肺癌的预后研究结果尚不一致。Monica等[4]对I－II期NSCLC的Survivin研究认为Survivin基因在早期NSCLC发生发展中起重要作用。Cagini等[5]曾对99例I－II期完全切除术后的肺癌患者的P53、Bcl?2、Ki?67等多个病理临床因数进行研究，发现P53、Bcl?2 、Ki?67并非I、II期NSCLC的独立预后因素。亦有研究[6]通过对Survivn在I期NSCLC的蛋白表达研究，认为Survivin的表达与患者预后无相关性，这可能与该研究中的分层后病例数少以及免疫组化染色分组误差有关。本研究将可能影响I期非小细胞肺癌预后的多个因素进行多因素分析，对I期非小细胞肺癌术后患者生存有显著意义的因素是Survivin蛋白的阳性表达（P=0.0015）和PTNM分期(P=0.0063)。对于I期非小细胞肺癌，局部生长为主，若Survivin蛋白在肿瘤细胞表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，使肿瘤不断的发展，这可能是早期肿瘤术后预后差的原因之一。本研究中通过分析发现Survivin和Bcl?2在I期NSCLC 的表达与各病理临床因数无相关性，两者的表达亦无相关性，这可能与两者抑制凋亡的途经不同有关。

    由上可见，在早期NSCLC中，Survivin及Bcl?2的过表达可能是肺癌早期的发展的原因之一，而Survivin在正常组织中的低表达，并且对术后患者预后的影响作用，通过进一步的研究可能会为早期NSCLC患者的方法及模式开辟一条新的途经。

【】
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[2] Tanaka K, Iwamoto S, Gon G, et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6 (1) : 127

[3] Sarela AI, Macadam RC, Farmery SM, et al. Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J]. Gut, 2000, 46 (5) : 645

[4] Monica Falleni, Caterina Pellegrini,1 Antonio Marchetti, et al.survivin gene expression in early stage non?small cell lung cancer [J]. Journal of Pathology，2003，200(5): 620

[5] Cagini L, Monacelli M, Giustozzi G, et al. Biological prognostic factors for early stage completely resected non?small cell lung cancer[J].J Surg Oncol,2000,74(1):53

[6] 朱志华，杨弘，傅剑华，等.Survivin 蛋白在早期非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系[J]. 癌症，2007，26（11）：1268