益舒软肝丸对肝硬化大鼠TGF?β1及TIMP?1表达的影响

【摘要】  目的 研究益舒软肝丸抗肝硬化的作用机理。方法 以CCl4复合因素法建立肝硬化模型，首先制备出肝硬化的实验动物模型，造模结束后，连续灌胃给药3个月。检查ALT、AST，A/G、CHE；HA、LN、PⅢNP、Hyp；TGF?β1和TIMP?1。结果 与模型对照组大鼠比，用药组组织切片显示汇管区有少量纤维组织增生，但未见假小叶结构；肝功能指标ALT、AST减少，A/G、CHE增加，肝功能有显著好转； HA、LN、PⅢNP、Hyp水平显著降低，肝纤维化程度降低；TGF?β1和TIMP?1阳性表达减少。结论 益舒软肝丸有明显的抗肝硬化的作用，其作用机制可能与下调大鼠组织TGF?β1和TIMP?1的表达，抑制细胞外基质的合成和胶原增生、沉积有关。

【关键词】  益舒软肝丸；肝硬化；CCl4

    ABSTRACT：Objective To investigate the effect and mechanism of Yishuruanganwan(YS) on liver fibrosis induced by CCl4.Methods 80 Wistar rats were randomly divided into normal group model group and three YS groups (0.4, 0.8 and 1.6 g/kg). The model of liver fibrosis was induced by CCl4 and high?fat diet in rats. After treatment with drug for 3 months, the histopathological change of liver was observed, the levels of ALT, AST, HA, LN, PⅢNP in serum, and the levels of A/G, CHE and Hyp in liver tissue were determined, and the expressions of  transforming growth factor beta (TGF?β1) and the tissue inhibitor of metalloproteinase?1(TIMP?1) was detected. Results Compared with model group, YS could significantly alleviate the histopathological injury of liver induced by CCl4, decrease the levels of ALT, AST, HA, LN and PⅢNP in serum, increase the levels of A/G, CHE, and reduce the content of Hyp in liver tissue. In addition, the expression of TGF?β1 and TIMP?1 in YS groups was markedly decreased as compared to model group (P<0.05). Conclusion YS has obvious protective effect on cirrhosis of liver and the mechanisms may be related with the decrease of TGF?β1 and TIMP?1 expression and the inhibition of extracellular matrix synthesis.

    KEY WORDS： Yishuruanganwan；Cirrhosis；CCl4

    各种病因引起肝细胞弥漫性炎性坏死、再生、诱发肝脏广泛的纤维结缔组织增生、小叶结构破坏、假小叶形成，纤维间隔包绕再生的肝细胞而形成大、小结节，隧成为肝硬化。目前西医肝硬化尚无特效疗法，而中药却在治疗上表现出独特的优势。益舒软肝丸为民间验方，由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、别甲、桃仁等中药组成，在长期临床实践中显示治疗肝硬化作用明显，临床疗效高，未见明显毒副作用[1]。 本实验研究益舒软肝丸的作用及机制，为其临床应用提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    Wistar雄性大鼠，清洁级，体质量100±20g，共48只。购自华中科技大学同济医学院（动物许可证号Scxk(鄂)2004?0007）。

    1.2  药品与主要试剂

    益舒软肝丸(Yishuruanganwan,YS)由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、鳖甲、桃仁等中药组成，粉成粉末过120目筛，由宜昌县人民药剂科制备。用双蒸水配成高（1.6g/kg体重）、中（0.8g/kg体重）、低（0.4g/kg体重）三个剂量组混悬液。金龙鱼大豆油由南海油脂有限公司生产。分析纯四氯化碳，上海试剂总厂生产，批号：20040515 。胆固醇，北京鼎国生物技术有限责任公司生产。羟脯氨酸（Hyp）试剂盒,南京建成生物工程研究所。血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）和 Ⅲ型前胶原（PⅢNP）放射免疫分析试剂盒,北京北方生物技术研究所。冰醋酸，武汉江北化学试剂有限责任公司，批号：20020829。兔抗鼠TIMP?1多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司。即用型SABC免疫组化试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司。兔抗鼠TGF?β1多克隆抗体，美国SANTA CRUZ。二步法免疫组化检测试剂，北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型DAB试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。

    1.3  实验动物分组及模型制备

    动物常规适应性饲养1周后开始实验，随机分为正常对照组（8只）和模型组。采用复合因素造模法[2?4]，模型组动物背部皮下注射40%CCl4油剂，首剂0.5ml/100g，以后每次0.3ml/100g，2次/周。同时采用高脂低蛋白食物：前2周，20%猪油+0.5%胆固醇+79.5%玉米面；后4周，0.5%胆固醇+99.5%玉米面。自由饮水。6周末随机取2只检测造模是否成功。造模成功后，改食普通饲料。模型组大鼠又随机分为模型对照组（n=12只）、YS 0.4g/kg组（n=10只）、0.8g/kg组（n=9只）、1.6g/kg组（n=9只）。模型对照组给予生理盐水（1ml/只）灌服，治疗组给予YS的混悬液灌胃，每天1次，连续灌胃12周，每周持续背部皮下注射CCl40.3ml/100g/次。12周末处死动物，留取血和肝组织标本。取左中叶相同部位，10%福尔马林溶液固定，制作病理石蜡切片。分别行HE、VG染色及TGF?β1和TIMP?1免疫组化分析。

    1.4  分析方法

    光镜下观察肝组织标本免疫组化结果。每张切片在显微镜下400倍随机采集10个视野（避开边缘效应），并要求每个观察视野包含一个汇管区或一个中央静脉,通过图文分析系统测定TGF?β1和TIMP?1免疫反应产物的阳性表达总面积和平均灰度值。免疫组化产物染色越深，灰度值越小，抗原物质的含量越高。

    1.5  统计处理

    采用SPSS10.0统计软件处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±标准差(±s)表示,组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间每两个均数的比较采用q检验。P<0.05为有显著性差异。

     2  结  果

    2.1  肝功能和肝纤维化相关指标检测结果

    模型对照组ALT、AST血清水平异常升高(P<0.05或0.01)， A/G明显降低, ALB、CHE降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。用药各组可明显降低血清ALT、AST水平，提高CHE，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。用药各组还可提高A/G、ALB降低AKP，但差异无统计学意义。见表1。各组大鼠血清肝纤维化指标检测结果，见表2。模型对照组HA、LN、PⅢNP明显升高，与正常组比较差异有显著性（P<0.01）；用药各组可明显降低HA、LN、PⅢNP的水平，与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；其中YS 0.8g/kg组降低HA、LN、PⅢNP作用最明显。由表可知，模型对照组Hyp含量最高，与正常组比差异有显著性（P<0.01）；用药各组可明显降低Hyp含量，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

    2.2  免疫组化结果

    由图1可见模型对照组TGF?β1的表达部位主要在汇管区周围细胞、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞、部分肝细胞以及纤维间隔内,呈棕黄色颗粒状,范围广；而正常对照组TGF?β1表达仅见于汇管区、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞,且着色较浅、范围窄。用药各组阳性表达有所降低，多见于中央静脉周围细胞、窦壁细胞、窦周细胞、汇管区周围细胞。图2显示正常组TIMP?1有弱阳性表达，仅见个别间质细胞和肝细胞的胞浆内，模型对照组TIMP?1表达明显增强，集中于纤维沉积处、汇管区和肝窦。用药各组表达有所降低，多散在分布，与模型对照组相比有明显差异。表1  YS对肝硬化大鼠肝功能的影响与正常组比较，△ P<0.05,△△ P<0.01；与模型对照组比较， * P<0.05,** P<0.01表2  YS对肝硬化大鼠HA、LN、PⅢNP和Hyp含量的影响由表3可见从肝纤维化程度来看，随着肝纤维化的形成及加重，TGF?β1和TIMP?1的表达逐渐升高。YS后不同程度减少。图像分析系统分析免疫组化染色结果显示，模型对照组TGF?β1和TIMP?1的阳性总面积明显增加，与正常组比较有显著差异（P<0.01）；用药组有不同程度减少，与模型对照组比差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。TGF?β1和TIMP?1的平均灰度值模型对照组最低，用药后有不同程度的提高，但差异无统计学意义。 表3  益舒软肝丸对肝硬化大鼠免疫组化的影响(±s)与正常组比较，△ P<0.05,△△ P<0.01；与模型对照组比较， * P<0.05,** P<0.01

    3  讨  论

    ECM合成和降解的主要调控因子是基质金属蛋白酶(MMPs)和组织基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)。基质金属蛋白酶类(MMPs)是一组锌钙依赖性内肽酶，它通过降低胶原螺旋结构的稳定性，改变底物的二级结构，为其他蛋白酶作进一步降解创造条件。其功能主要是降解诸如胶原、蛋白聚糖等细胞外基质成分，在正常胚胎发育、器官发生、血管形成、创伤愈合过程以及关节炎、骨质疏松、组织纤维化等多种疾病过程中起着重要作用。TIMPs是一组具有抑制MMPs功能的活性多肽，它不但与MMP酶原以1:1形式相结合抑制其活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能，抑制ECM的降解[5，6]。

    肝纤维化时TIMP?1大量表达，使MMPs活性减少，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少，沉积增多，而通过抑制TIMP?1的表达，可有效抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生，从而延缓纤维化的。本实验结果显示用药组肝组织TIMP?1的阳性总面积减少，平均灰度值增加。提示YS可能通过抑制TIMP?1表达是促进ECM降解，拮抗肝硬化。

    TGF?β（主要是TGF?β1）是迄今为止被认为最强的致纤维化因子，其作用机制有[7]： ①能刺激肝脏成纤维细胞合成胶原；②能抑制HSC胶原酶表达及促进TIMP的产生，减少ECM的降解，结果ECM净生成增加；③可刺激HSC合成PDGF，并增加PDGF受体的表达，从而促进HSC的增殖。本实验结果显示，用药组肝组织TGF?β1的阳性总面积减少，平均灰度值增加。提示YS可能通过抑制TGF?β1的表达，使HSC的增殖活化得到抑制，减少胶原合成，增加ECM的降解，从而抗肝硬化。

    益舒软肝丸治疗早期肝硬化大鼠的疗效好，其机制可能有:抑制转化生长因子β1使肝星状细胞的增殖活化得到抑制,减少胶原合成,增加细胞外基质的降解;抑制基质金属蛋白酶抑制因子1表达，促进细胞外基质降解，拮抗肝硬化。

【】
  [1]王希君，张亮燕，张国爱，等.益舒软肝丸对肝硬化逆转作用的临床疗效观察[J].时珍国医国药，2006，1

[2]周忠信，王捷.肝硬化动物模型研究进展[J].上海实验动物,2002,22(4):245

[3]周婷,杨军,王勇.四氯化碳加乙醇制备实验性肝硬化大鼠模型[J].农垦医学,2003,25(2):152

[4]马学惠.肝纤维化动物模型的造模方法[J].中华肝脏病杂志,1996,4(1):58

[5] 邹海峰,刘洋,徐华锋，等.TIMP?1在肝纤维化形成过程中的作用[J].哈尔滨医科大学学报,2005,39(1):25

[6] 王宝恩.肝纤维化及肝硬变的可逆性[J].中西医结合肝病杂志,2000增刊:2

[7] 张愚,屈文东,柳利民，等.TGF?β1在实验性肝硬化中的免疫组化研究[J].大院学报,2005,4(1):49