复方参七汤对胃、结直肠癌抑制作用的实验研究

                   作者：钱晶晶，沈洪薰，陆/飞，周树军，陈玉泉

【摘要】  　　目的：研究复方参七汤胃、结直肠癌的作用机制。方法：（1）复方参七汤对人胃癌细胞的体外抑制实验；（2）对MNNG诱发大鼠腺胃癌的体内抑制诱癌率实验；（3）对裸鼠结肠癌肝转移的体内抑制实验。结果：（1）复方参七汤对人胃癌BGC-823细胞株半数杀伤浓度（LC50）为0.048 g/ml，随药物浓度增高，杀伤作用亦增强；半数抑制浓度（IC50）为0.007 g/ml，随药物浓度增高，抑制有丝分裂指数逐渐减小，而抑制细胞集落形成亦增大；（2）复方参七汤对MNNG诱发大鼠腺胃癌发生率明显降低，实验组为6.9%(3/43)显著低于对照组58.9%(23/39)，（P<0.01)；对MNNG诱发大鼠腺胃癌组织中PCNA和CyclinD1阳性表达明显降低，实验组为13.88%(5/36)和22.86%(8/35)，显著低于对照组75.76%(25/33)和62.86%(22/35)，（P<0.01)；（3）复方参七汤对人结肠癌LS174t细胞株接种裸鼠肝转移的肝转移数、肝转移癌重和肝癌重/肝重明显降低，实验组为2.42±0.99，63.67±21.29和8.90±3.10，显著低于对照组4.17±1.99，94.32±37.86和13.20±5.30（P<0.05)；对裸鼠肝转移血中CK20 mRNA表达的相对值减少，实验组为0.398±0.143显著低于对照组0.518±0.090，（P<0.05)；对裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK阳性表达呈过表达，实验组为66.67%(8/12)显著高于对照组16.6%(2/12)，（P<0.05)。结论：复方参七汤在体外实验有杀伤癌细胞作用；在体内实验抑制大鼠对MNNG诱癌率；抑制裸鼠对人结肠癌细胞肝转移的作用。

【关键词】  胃癌 复方参七汤 肝转移

　　[Abstract]   Objective: To investigate the mechanism of therapeutic effect of compound Shenqitang on the gastric and colorectal carcinomas. Methods: Several experiments had been done, including:(1) the inhibitory effect of compound Shenqitang on human gastric adenocarcinoma cell line in vitro；(2) its inhibitory effects on Wistar rat gastric adenocarcinoma induced by MNNG; and (3) its inhibitory effect  on the hepatic metastases of colorectal carcinoma in mice. Results: （1）Obvious inhibitory effects of compound Shenqitang had been found on the cell division and colony form of human gastric adenocarcinoma cell line BGC-823 in vitro. The LC50 was 0.007g crude drug/ml in colony form experiment. The drug had potent killing effect in higher concentration, with LC50 of 0.048g crude drug/ml；（2）The incidence of gastric adenocarcinoma in the experimental group(6.9%) was significantly lower than that in the control group(58.9%).The positive rates of PCNA and cyclin D1 in the experimental group were 13.88%(5/36) and 22.86%(8/35), which were significantly lower than those in the control group（P<0.01)；（3）Compound Shenqitang  inhibited hepatic metastases of colorectal carcinoma in mouse model. Nm23H1-NDPK positive expression rate (66.67%) was significantly higher in the experimental group than that (16.67%) in the  control group（P<0.05). Conclusion:  Compound Shenqitang can effectively kill the human gastric adnocarcinoma cell line BGC-823 in vitro, inhibit the incidence of the gastric adenocarcinoma induced by MNNG in Wistar rats, and inhibit  hepatic metastasis of colon carcinoma in mouse model.

　　[Key words]   Gastric  carcinoma; Compound Shenqitang; Hepatic metastasis

　　复方参七汤在外科综合治疗胃、结直肠癌中具有重要临床意义，提高术后5年生存率分别为80%和79.17%[1~3]，为探讨其抗癌机制，本文进行了复方参七汤体内、外抑癌实验研究，现报告如下。

　　1   材料与方法

　　1.1   材料   人结肠腺癌LS174t细胞株购于中科院上海细胞库，人胃癌细胞株BGC-823购于中科院上海细胞生物研究所，24只(4～6周龄)裸鼠购于中科院上海实验动物中心，100只纯系（6周龄）体重45 g左右Wistar大鼠，本院实验动物中心，复方参七汤  沈洪薰教授的经验方，由参三七、人参、黄芪、黄精、当归、陈皮、木香、伏苓、甘草、川贝、草乌、半边莲、半枝莲、谷、麦芽、佛手花等17味中药组成，化学致癌剂：N-甲基- N-硝基- N-亚硝基胍（N-methyl-N'Nitro-N-Nitrosonguanidine，MNNG），淡黄色结晶，购自日本东京化学试剂公司产品。

　　1.2   方法

    1.2.1   复方参七汤制备和消毒   将复方参七汤中药煎煮浓缩至每毫升药液约含1 g生药，过滤沉淀。加入2倍量95%乙醇，4 ℃过夜，滤纸过滤，并浓缩至每毫升药液含2 g生药。按上述方法重复2次，滤液加热浓缩至每毫升药液含3 g生药，G3型漏斗过滤，30分钟高压蒸汽灭菌后待用。

　　1.2.2   杀伤效应试验   按染料排斥试验法将人胃癌细胞株BGC-823细胞接种于25 ml培养瓶中，每瓶3×105个细胞，加含10%小牛血清的RPMI-1640培养基4 ml培养过夜，换以用培养基稀释的复方参七汤中药，稀释倍数分别为1∶10、20、40、80、60、320、640；对照组换以新鲜培养液。培养48 h后换新鲜培养液继续培养24 h，取细胞悬液0.4 ml，加0.4%台盼篮液染色后用血球计数板计数200个细胞，杀伤率。杀伤率=染色细胞数/细胞总数×100%。以浓度的对数与杀伤率作图，求出半数杀伤浓度（LC50）。

　　1.2.3   BGC-823细胞分裂   将盖玻片裁成小条放入25 ml培养瓶中。将人胃癌细胞株BGC-823细胞悬液接种在盖玻片上，培养过夜。换以用培养基稀释的复方参三七中药；对照组换新鲜培养液。24 h后，换培养液继续培养24 h，取出盖玻片，PBS漂洗，甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定液中固定30 min，Giemsa液染色10 min，镜检1000个细胞计算分裂指数。分裂指数=平均各期分裂细胞数/总细胞数×100%。

　　1.2.4   BGC-823细胞株集落形成   取15 ml培养瓶，BGC-823细胞悬液2 ml，分别加入浓度为1∶80、160、240、320、400和1∶640的复方参三七中药；对照组不加药。培养24 h后换培养液，继续培养1周。甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定液中固定，Giemsa 液染色，在20倍光镜下计数含50个细胞以上的集落，计算集落形成抑制率。集落形成抑制率=（种入细胞数-平均集落数）/种入细胞数×100%。以浓度的对数与集落形成抑制率作图，求出半数抑制浓度（IC50）。

　　1.2.5   实验组Wistar大鼠（50只）自由摄取MNNG 100 μg/ml溶液，连续9个月， 前6周，每周1次用1 ml饱和氯化钠溶液灌胃，自由喂给含复方参七汤（按3.6 ml/200 g大鼠体重）颗粒饲料，每日1次，连续喂养9个月；对照组（50只）不喂药，余与实验组相同。

　　1.2.6   Wistar大鼠实验诱癌期间观察   每天观察2次，每1~2月测量大鼠体重1次，实验诱癌期间死亡大鼠均作尸检，观察病改变和胃肠道癌肿发生率。

　　1.2.7   光镜观察实验组与对照组分批，取胃、十二指肠，大肠和小肠，心肝肺等脏器，胃十二指肠沿大弯侧切开，观察黏膜病变，作组织切片，HE染色，光镜观察组织形态。

　　1.2.8   免疫组化S-P法检测增殖细胞核抗原(PCNA)，细胞周期素D1(Cyclin D1)nm23H1-NDPK，鼠抗PCNA(ZYMED公司产品)，鼠抗Cyclin D1为SantaCruz公司产品，SP试剂盒购于福建迈新公司，设已知阳性切片的阳性对照及PBS代替一抗的阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性反应。

　　1.2.9   裸鼠结直肠癌肝转移模型   实验组和对照组BALB/C裸鼠各12只。裸鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，打开腹腔，显露脾脏。用4号针将0.1 ml细胞悬液缓慢注入脾脏下极的包膜下，拔出针头，于注射点用75%乙醇棉球压迫出血点，并杀死外渗的肿瘤细胞，5 min后将脾脏切除，腹壁全层缝合，置于SPF动物房中继续喂养。实验组每日喂以含0.6 ml/20 g体重复方参七汤颗粒饲料。对照组裸鼠喂以颗粒饲料。

　　1.2.10   大体观察   观察裸鼠的生长变化，每天记录裸鼠体重、摄食量及活动。喂养3周，处死前抽取各组裸鼠心脏血，检查肝转移癌结节数目，挖出各个癌结节并称癌重。

　　1.2.11   CK20 mRNA检测   从24只人结肠癌裸鼠肝转移的心脏采集血标本和另取10只正常裸鼠心脏血标本分别置于肝素抗凝管内，混匀，立即处理。引物合成：按报道基因序列合成CK20引物A，B，C，D和引物β-actin，引物1，2，由上海中科院分子生物研究所合成。

　　CK20  A: 5'-CAGACACACGGTGAACTATGG-3'，

　　B: 5'-GATCAGCTTCCACTGTTAGACG-3'，

　　C: 5'-CGTTTGTTGGCAATGAGAAAA-TGG-3'，

　　D: 5'-GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT-3'。

　　β-actin 1: 5'-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3'，

　　2: 5'-GTTTTCTGCGCAAGGTTAGG-3'。

　　巢式PCR： 循环条件为95 ℃ 10 s，63 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s共35个循环。2次PCR扩增，除引物和模板外，其余均相同。对扩增产物进行酶切，2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，四星图像处理系统照像。

　　1.3   统计学方法   采用Stata7.0软件，计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，计数资料用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2   结      果

　　2.1   复方参七汤对人胃癌细胞株BGC-823体外抑制试验结果

　　2.1.1   对BGC-823杀伤效应及对分裂指数的影响   见表1。随药物浓度的增高，杀伤作用也增强，分裂指数逐渐减少，直线回归处理，求出复方参七汤对BGC-823半数杀伤浓度为0.048 g/ml。

　　2.1.2   对BGC-823集落形成的影响   见表2。随浓度增高，集落形成抑制率而增大，经直线回归求出半数抑制浓度（IC50）为0.007 g/ml。

　　2.2   复方参七汤对Wistar大鼠实验组与对照组MNNG诱发胃癌的实验结果   见表3，图1~4。

　　2.2.1   复方参七汤对Wistar大鼠MNNG诱发胃癌影响（表3）

　　2.2.2   复方参七汤对Wistar大鼠MNNG诱发胃癌的免疫组化PCNA、CyclinD1表达影响（表4）

　　 2.3   复方参七汤对BALB/C裸鼠结直肠癌肝转移实验结果

　　2.3.1   复方参七汤对裸鼠肝转移灶的影响（见表5)。

　　2.3.2   复方参七汤对裸鼠肝转移血中CK20 mRNA表达影响   实验组和对照组裸鼠肝转移血中CK20 mRNA阳性表达率分别为91.6%（11/12）和100.0%（12/12），P>0.05，另外10只裸鼠血中CK20 mRNA均呈阴性表达，随后对实验组和对照组裸鼠血中CK20 mRNA采用半定量法，出CK20 mRNA表达的相对值，实验组0.398±0.143，对照组0.518±0.090，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

　　2.3.3   复方参七汤对裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达影响   实验组裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达为66.67%(8/12)，对照组裸鼠肝转移组织中nm23H1-NDPK表达为16.67%(2/12)，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

　　3   讨      论

　　3.1   复方参七汤可提高胃结直肠癌的手术疗效  已有报道胃癌术后患者长期服用复方参七汤组5年、8年和10年生存率分别为80%、60%、57.1%，优于对照组的58.6%、40%和14.3%（P<0.05）[2]。有报道结直肠癌术后患者长期服用复方参七汤，长期服用中药3年、5年生存率分别为80.95%和66.67%，优于对照组，分别为47.62%和33.33%[1]（P<0.05）。

　　3.2   体外实验抑制人胃癌细胞   本研究显示复方参七汤对人胃癌细胞株BGC-823细胞具有直接杀伤效应， LC50为0.048 g/ml；对BGC-823细胞的有丝分裂有抑制作用；对BGC-823细胞集落形成有抑制作用，IC50为0.007 g/ml。这些结果表明中药复方参七汤可直接杀伤癌细胞，与张氏报道复方中药注射液对人胃癌细胞有杀伤效应相同[4]。

　　3.3   体内实验抑制大鼠诱发胃癌   MNNG胃腺癌诱发率为63%~90%[5]，朱氏报道为80.7%[6]。本组为58.9%，可能与大鼠对MNNG的敏感性、含量、浓度和服用时间有关。本组这一表现提示复方参七汤对MNNG致胃黏膜直接损害有保护作用。

　　本实验应用PCNA和Cyclin D1表达程度来反映大鼠腺胃细胞增殖程度和增殖性细胞周期G1的变化，由表3可发现，对照组PCNA和Cyclin D1表达分别为75.76%和62.86%，与我们研究的PCNA标记指数（PCNA Li），Cyclin D1表达61.88%和80.88%相近[7]。但实验组PCNA和Cyclin D1表达明显下降，分别为13.88%和22.86%。这一表现提示复方参七汤具有降低大鼠MNNG诱发腺胃癌中的PCNA和Cyclin D1表达，抑制诱发胃癌的发生与，这与徐莉报道的参麦可减少肿瘤中PCNA表达的结果相似[8]。

　　3.4   体内实验抑制裸鼠结直肠癌肝转移   实验组裸鼠实验前后体重增长明显高于对照组；实验组裸鼠肝转移癌结节的数目明显少于对照组；实验组裸鼠肝转移癌重明显低于对照组；实验组裸鼠肝转移癌重/肝重比例明显低于对照组。这些表现阐明复方参七汤具有抑制人结肠癌细胞肝转移的作用。血中CK20 mRNA表达可作为人结肠癌细胞存在于循环的指标：谬氏报道[9]大肠癌患者外周血中CK20和CEA阳性表达是大肠癌患者外周血存在癌细胞的重要证据。本组研究发现正常裸鼠血中CK20 mRNA为阴性，而实验组血中CK20 mRNA表达的相对值明显低于对照组，提示复方参七汤可抑制裸鼠结肠癌肝转移血中CK20 mRNA表达。nm23H1可作为复方参七汤抑制裸鼠结肠癌肝转移指标。本实验成功建立了人结肠癌细胞株接种裸鼠肝转移模型，肝转移组织中nm23阳性表达率66.67%（8/12）明显高于对照组16.6%（2/12），与何萍[10]报道nm23H1蛋白表达与肿瘤远处转移之间呈负相关结论相似，提示复方参七汤具有抑制结直肠癌肝转移作用。

【文献】
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