RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响
作者：芮理，薛万江，李鹏，王鹏，王志伟，李厚祥
【摘要】 目的：研究RASSF1A提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用。方法：通过脂质体介导的基因转染法将RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染肝癌细胞株QGY-7703，G418筛选稳定表达株，并以RT-PCR和Western Blot进行鉴定目的基因的表达。化疗药物阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、鬼臼乙叉甙(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)分别作用各细胞株后，检测各细胞株的生长抑制率。结果：经800 μg/ml 的G418最佳筛选浓度筛选QGY-7703细胞株，成功建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株。以QGY-7703细胞为对照，MMC对表达RASSF1A基因的肝癌细胞的生长抑制率最大为21%。结论：RASSF1A基因的表达可明显提高肝癌细胞对MMC的敏感性。RASSF1A的表达不影响肝癌细胞QGY-7703对ADM、 VP-16、5-FU和DDP敏感性。
【关键词】 肝细胞癌 Ras association domain family 1A 药物敏感性 逆转录聚合酶链反应
[Abstract] Objective：To investigate the effects of RASSF1A gene expression on the chemosensitivity of human hepatocellular carcinoma cell（HCC）. Methods：RASSF1A expression vector and empty vector were transfected into HCC cell line QGY-7703 with Lipofectamine 2000 reagents. The positive clones that expressed RASSF1A gene stably were chosen by G418 and checked by RT-PCR and Western Blot. Cell inhibited rate（IR） was measured after the treatment with the antitumor agents ADM, MMC, VP-16, 5-FU and DDP. Results：The HCC cell lines that reexpressed RASSF1A gene stably were established successfully. The suitable concentration of G418 used for selection agent was 800 μg/ml for QGY-7703 cell line. After being treated with MMC, the IR of cells reexpressing RASSF1A was maximal，and it was 21%, using QGY-7703 cell as control. Conclusion： The expression of RASSF1A could increase the cell IR induced by MMC. RASSF1A gene expression had no effect on the chemosensitivity of human hepatocellular carcinoma cell treated with ADM, VP-16, 5-FU and DDP.
[Key words] Hepatocellular carcinoma; Ras association domain family 1A; Drug-sensitivity； Rerverse transcriptase polymerase chain reactionRASSF1A（ras association domain family 1A）基因是近年来发现的一个重要的抑癌基因，其抑制肺癌、肾癌、膀胱癌细胞生长的功能已得到证实[1~3]。通过瞬时转染发现，RASSF1A基因的表达使肺癌细胞株NCI-H1299生长阻止在G1/S期与抑制细胞周期蛋白cyclin D1的表达累积有关[4，5]。但对于RASS-F1A基因的表达对化疗药物敏感性的研究国内外尚未见报道，本研究通过建立稳定表达RASSF1A基因的肝癌细胞株，观察RASSF1A基因表达对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响。
1 材料和方法
1．1 质粒、细胞株及主要试剂 pcDNA3.1(+)RASSF1A质粒由美国Pfeifer博士惠赠[1]。真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，肝癌细胞株QGY-7703由国家人类基因组南方研究中心常规保存，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。所有细胞均在37.0 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养。脂质体Lipofectamine 2000、G418、Trizol RNA抽提试剂、二抗羊抗鼠IgG-HRP均购自Gibco公司；一抗鼠抗人RASSF1A单克隆抗体购自eBioscience公司；RNA逆转录酶SuperScript Ⅱ reverse transcriptase购自 Clothe公司； Cell Titer 96（R） AQueous Non-Radioative Cell Proliferation Assay试剂盒购自Progema公司。
1．2 G418对肝癌细胞株的毒性试验 各细胞株按1×105/孔接种于6孔板，细胞贴壁后，按0、200、400、600、800、1000 μg/ml 的G418浓度加入相应培养基，每周换液2次，2周后弃培养基。
1．3 稳定表达株的建立 严格参照Lipofectamine 2000说明书，将纯化的质粒pcDNA3.1(+)RASSF1A（经测序鉴定）及 pcDNA3.1(+)各2 μg转染对数生长期的QGY-7703，转染后20 h换新鲜培养基，48 h后以1︰10稀释传代培养，72 h后按相应浓度的G418进行筛选。待转染细胞呈小克隆生长时，用Disco 纸片将G418抗性细胞克隆依次转到96孔板、24孔板、6孔板或35 mm培养皿中扩大培养。收集细胞蛋白，RT-PCR和Western Blot鉴定是否有目的基因的表达，并将阳性细胞克隆冻存备用。
1．4 RT-PCR Trizol法提取各组细胞的总RNA，逆转录反应使用随机引物OligdT18合成第一链(严格按照厂家说明书进行)。RASSF1A引物序列
R1：5′-GATGAAGCCTGTGTAAGAACCGTCCT-3′，
R2：5′-CAGATTG-CAAGTTCACCTGCCACTA-3′，
扩增产物为245 bp；内参照β-actin,
β1:5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'，
β2:5'- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′，
扩增产物为 300 bp。退火温度均为58 ℃；PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳。
1．5 Western Blot 取40 μg 细胞裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白电转至PVDF膜上，固定封闭后，依次与一抗、二抗结合，增强化学发光法（ECL）显色后暗室显影。
1．6 药物敏感性实验（药物作用浓度根据已知的临床研究过的血浆浓度为基础） 将各克隆细胞接种到96孔板中，每孔1×104个细胞，每组设3复孔，实验组第2天以终浓度为3.0 μg/ml加化疗药物丝裂霉素(mitomycin, MMC)，0.5 μg/ml加化疗药物阿霉素(adriamycin ADM)，1.6 μg/ml加化疗药物鬼臼乙叉甙(etoposide, VP-16), 3.0 μg/ml加化疗药物顺铂(cisplatin, DDP)，6.0 μg/ml加化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracilur, 5-FU)，对照组不加化疗药物。24 h后进行细胞生长抑制率（cell inhibited rate，IR）的测定，采用Progema公司的Cell Titer 96（R） AQueous Non-Radioative Cell Proliferation Assay 试剂盒检测，方法产品说明。公式：
IR=■ ×100%
1．7 统计学方法 采用组间t检验，P＜0.05示差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 G418毒性试验 QGY-7703细胞株加G418 5天后600 μg/ml以上组细胞均出现大量死亡，14天后800 μg/ml以上组细胞全部死亡。以14天后使细胞全部死亡的最低G418浓度为本次实验的最佳筛选浓度的原则, QGY-7703细胞株的G418最佳筛选浓度为800 μg/ml。
2．2 RASSF1A稳定表达细胞株的建立 见图1。转染细胞经800 μg/ml G418筛选3周左右，可见少量单细胞增殖形成的阳性细胞克隆，这表明各质粒成功转染培养细胞。QGY-7703细胞pcDNA3.1(+)RASSF1A转染组克隆形成数目明显少于空载组。随机各挑选20个生长状态良好的阳性克隆扩大培养，通过检测目的基因的表达，肝癌细胞株QGY-7703获得1个稳定表达RASSF1A基因的细胞克隆，命名为Q。RT-PCR结果显示该G418抗性细胞克隆有245 bp的目的条带，Western Blot 分析也显示有1条38.8 kD的目的条带，说明这组细胞有外源性RASSF1A基因的转录和翻译。另外还选得一表达空载体pcDNA3.1(+)的肝癌细胞株QGY-7703，命名为P。
2．3 组细胞对各化疗药物敏感性比较 见表1。由表1可见RASSF1A基因的表达可明显提高肝癌细胞QGY-7703对MMC的敏感性。我们未发现RASSF1A的表达使肝癌细胞QGY-7703在ADM、VP-16、5-FU和DDP作用后IR差异有统计学意义。
3 讨 论
RASSF1A基因定位于人染色体3p21.3，全长1968 bp，是RASSF1基因家族中的主要一员。其cDNA序列中含有6个外显子，编码由340个氨基酸组成的分子量为38.8 kD的蛋白质。由于其肽链组成C末端的氨基酸组成顺序与小鼠Ras基因作用通路上的效应基因Nore1/Haxp1蛋白质的氨基酸的组成顺序有高度的同源性(>55%)而得名。该蛋白质的具体生物学功能目前还未完全了解。
MMC是一种常用的周期非特异性的细胞毒性药物，作用机理主要和DNA双链交叉连接，抑制DNA复制，并使部分DNA断裂。MMC是近年来在肝癌化疗中常用的药物之一，但由于肿瘤耐药性的出现或肿瘤负荷的增加,可最终导致化疗效果不佳。因此，研究肝癌的化疗影响因素具有一定的临床价值。
本实验利用脂质体介导的转染技术成功地将RASSF1A cDNA导入了肝癌细胞QGY-7703中，获得了能稳定表达外源性RASSF1A蛋白的肝癌细胞克隆Q。结果显示，Q对MMC的敏感性增强，其主要作用机理可能为诱导敏感靶细胞的凋亡。化疗药物作用于肿瘤细胞中特定的靶点如DNA、RNA、微管等并导致其损伤，继而通过死亡受体—配体途径和（或）促使线粒体释放细胞色素C，激活细胞凋亡过程中的关键酶caspases，再由活化的caspases作用于其底物，使肿瘤细胞发生凋亡并呈现出细胞凋亡的一系列特征性形态学改变，如染色质凝聚、凋亡小体形成并由周围巨噬细胞吞噬等。
本研究发现，转染野生型RASSF1A基因后再联合应用MMC，肝癌细胞在原本不敏感的药物浓度作用下出现了明显的生长抑制效应。实验结果表明恢复RASSF1A基因的功能，可提高肝癌细胞对部分化疗药物的敏感性。可见，RASSF1A基因联合化疗药物对肝癌的是一种可行、有效的治疗手段。
【参考】
[1] Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of a Ras association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3[J]. Nat Genet, 2000，25（3）:315-319.
[2] Igor K, John WG, Alexei P, et al. The RASSF1A tumor suppressor gene is inactivated in prostate tumors and suppresses growth of prostate carcinoma cells[J]. Cancer Res,2002，62（12）:3498-3502.
[3] Koen D, Eleonora B, Igor K, et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumo；rigenesis[J]. PNAS, 2001，98（13）:7504-7509.
[4] Latha S, John M, Toshiyuki S, et al. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation[J]. Mol Cell Biol,2002，22（12）:4309-4318.
[5] 姚登福. 基因表达异常与肝癌诊断、转移及复发监测[J]. 南通大学学报（医学版），2007，27（4）：235-239.
