血红素氧合酶1对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用研究

                  作者：陆卫华，邵素花，许喜咏，唐忠志，陈忠庆   

【摘要】  　　目的 探讨血红素氧合酶?1(HO?1)对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的效果及作用机制。方法 采用HO?1的诱导剂钴原卟啉(CoPP) 和抑制剂锌原卟啉(ZnPP) 分别进行干预处理后，建立大鼠的心肌缺血-再灌注损伤模型，观察大鼠再灌注后心肌形态变化；检测血红素氧合酶?1基因在大鼠心肌的表达情况；测定大鼠左心室心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。结果 再灌注前使用CoPP 进行预处理，可以诱导HO?1蛋白的表达上调。HO?1蛋白表达上调可以减少缺血-再灌注后的心肌细胞坏死，提高心肌组织中SOD含量并降低MDA的含量。结论 CoPP诱导的HO?1过表达可以抑制心肌缺血-再灌注损伤后的细胞坏死，从而减轻心肌的再灌注损伤，其主要机制与抗氧自由基有关。

【关键词】  血红素氧合酶?1；心肌缺血-再灌注损伤；保护作用；抗氧自由基

　　Abstract： Objective  To investigate the protective effects of heme oxygenase (HO)?1 on myocardial ischemia/reperfusion injury of rats in vivo, and explore the possible mechanism. Methods  Rat myocardial ischemia/reperfusion injury models were established. The expression of HO?1 mRNA was detected by RT?PCR. The vitality of SOD and the quantity of MDA were detected in rat myocardial ischemia/reperfusion injury models treated with HO?1 inducer cobalt protoporphyrin (CoPP) or zinc protoporphyrin (HO?1 inhibitor).Results  Pretreatment of CoPP before reperfusion up?regulated the expression of HO?1, enhanced the vitality of SOD, decreased the quantity of MDA, and subsequently reduced the incidence of necrosis atter myocardial reperfusion. Conclusion  The up?regulation of HO?1 expression induced by CoPP can inhibit the necrosis of the myocardial cells and subsequently alleviate the myocardial ischemia/reperfusion injury. One of its main mechanisms may be related with anti?oxygen free radicals.

　　Key  words： heme oxygenase?1; myocardial ischemic reperfusion injury; protection; anti?oxygen free radical

    心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemia repergusion injury，MIRI）即缺血性损伤基础上叠加由再灌注所加剧的组织损伤，其比单纯缺血性损伤更为严重。心肌缺血-再灌注损伤是临床常见的一种病理生理变化。缺血-再灌注后的心肌保护一直是研究的焦点，血红素氧合酶(HO) 是血红素降解的起始酶和限速酶，它不仅直接降解血红素,同时消耗氧和，而且能够通过血红素的降解产物发挥其细胞保护功能[1]。本实验采用HO?1的诱导剂和抑制剂进行干预，观察HO?1 在心肌缺血-再灌注损伤中的表达情况，旨在研究HO?1 在心肌缺血-再灌注损伤中的意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物和材料 

　　清洁级健康雄性SD大鼠，体重300±30g，由武汉大学医学动物实验中心提供。RT?PCR 试剂盒(深圳晶美生物公司)，钴原卟啉(CoPP) 和锌原卟啉(ZnPP) (美国Frontier Scientific 公司)， 大鼠SOD（超氧化物歧化酶）及MDA（丙二醛）试剂盒（均购于南京建成生物工程研究所）。

　　1.2  心肌缺血-再灌注大鼠模型的建立及其分组

　　1.2.1 将60只大鼠随机分为3组，每组20只：(1)对照组，术前24 h 注射生理盐水；(2)CoPP组，依据[2]，术前24 h 注射CoPP 5 mg/ kg；(3)ZnPP组，依据文献[2]，术前24 h 注射ZnPP 5 mg/ kg。

　　1.2.2  模型制作
 
　　大鼠腹腔注射20%乌拉坦40 mg/kg 麻醉后行气管切开进行人工机械通气（呼吸频率68～70 次/min，潮气量1.2 L/kg），右颈动脉置管用于采集血液标本，沿胸骨左缘第4肋间开胸，在左心耳与肺动脉圆锥之间找到与左冠状动脉伴行的心大静脉并使之充分暴露，连同心大静脉一起结扎左冠状动脉前降支。结扎冠状动脉后，迅速将心脏放入胸腔，胸部皮肤用12～14#血管钳闭合胸腔。30 min 后实施再灌注。再灌注120 min 后，取标本。以结扎后左心室前壁结扎下心肌颜色发绀(或变白) 和运动功能下降，放松丝线则先前缺血心肌颜色立刻恢复正常为鲜红色表明缺血-再灌注成功。未到观察终点而死亡以及造模不成功者剔除。

　　1.3  检测指标及方法

　　1.3.1  HE染色观察 

　　实验结束后，每组随机抽取两只大鼠，立即处死，取下心脏，于生理盐水中漂洗，除去血液后，放入4%甲醛中固定。从心尖开始以间距0.3 cm 横向连续切片至冠脉穿线处，石蜡包埋切片，常规HE染色，编号，光镜下观察心肌形态变化。

　　1.3.2  RT?PCR法检测HO1mRNA的表达 

　　使用Trizol试剂盒从200 mg 新鲜缺血区心肌组织中提取总RNA，使用RT?PCR试剂盒进行RT?PCR检测。扩增HO?1的上游引物：5′?CGGCCCTGGAAGAGGAGATAG?3′；下游引物：5′?GGTGGGGTTGTCGATGCTCGG?3′；扩增内参三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的上游引物： 5′?TTCAACGGCACAGTCAAG3′；下游引物：5′?CACACCCATCACAAACAT?3′。扩增条件为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，扩增30个循环，72 ℃ 后延伸10 min。扩增产物经2 %的琼脂糖电泳，利用Sensiansy 凝胶图像分析软件拍照并进行图像分析。

　　1.3.3  大鼠心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的测定 

　　处死大鼠，取下心脏，迅速剪下缺血区组织200 mg 于生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干，制作10%心肌组织匀浆，离心后取0.5 ml 上清液，以黄嘌呤氧化酶法测定左心室心肌组织SOD活性，以硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法测定MDA含量，可用分光光度计进行定量测定。其步骤和公式严格按照试剂盒说明书操作。

　　1.4  统计学方法 

　　实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.0统计软件包进行单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

　　2.1  HO?1对心肌组织病理形态学的影响 

　　石蜡切片HE染色，光学显微镜下结果显示，生理盐水组及ZnPP组心肌纤维断裂，有灶性出血，心肌间质可见大量炎性细胞浸润（见封4图1、2）；CoPP组心肌纤维呈波浪状，胞浆分布不均，心肌间质无出血，有少量不等的炎性细胞浸润（见封4图3）。

　　2.2  RT?PCR法检测HO?1mRNA的表达 

　　由图4可见，提取三组大鼠的缺血心肌组织的总RNA后，进行RT?PCR。M：marker；1：ZnPP组；2：生理盐水组；3：CoPP组。凝胶成像系统拍照分析，用样本灰度值比内参值所得数据见表1。结果显示：三组间HO?1的mRNA表达量有统计学意义（P<0.01）；CoPP组HO?1的mRNA表达量较其他组明显升高（P<0.01）。表1  再灌注后各组HO?1 mRNA /GAPDH 的比值（略）

　　2.3  HO?1对大鼠缺血?

　　再灌注左心室心肌SOD、MDA的影响  ZnPP组大鼠与生理盐水组及CoPP组比较，心肌组织中SOD活性明显下降（P<0.01），而MDA生成量明显升高（P<0.01）。生理盐水组与CoPP组比较，心肌组织中SOD活性明显下降（P<0.01），而MDA生成量明显升高（P<0.01），见表2。表2  各组心肌组织中SOD活性和MDA含量的变化（略）

　　3  讨论

    心肌缺血-再灌注损伤是一种多因素参与的复杂病理过程，是阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，研究和探讨心肌缺血-再灌注损伤的机制以及减轻这种心肌损伤的有效措施已成为心脏病学领域中的重大课题。HO是血红素降解的起始酶和限速酶，最初人们认为它的作用仅限于催化血红素氧化降解，保持体内血红素的平衡。可近年的研究发现，HO对多种组织的缺血-再灌注起到显著性保护作用[3～4]。HO?1是其诱导型，在许多应激性损伤和炎症反应中，HO?1表达增加；用HO?1诱导剂或转基因技术使组织中HO?1表达增加可明显增强组织的抗氧化损伤能力，抑制炎症反应，减轻缺血-再灌注损伤，对缺血-再灌注组织具有明显的保护作用[5]，但其作用机制尚不十分清楚。据此，本实验采用结扎冠状动脉前降支的方法制备大鼠心肌缺血-再灌注模型，通过比较心肌病理形态，观察了HO?1对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。并通过测定心肌组织中SOD活性及MDA含量，对HO?1的作用机制进行了初步探讨。
   
　　本实验心肌石蜡切片HE染色结果显示，生理盐水组及ZnPP组可见明显的心肌纤维断裂、坏死，灶性出血及大量炎性细胞浸润，而CoPP组心肌纤维呈波浪状，肌浆分布不均，可见少量不等的炎性细胞浸润。说明心肌缺血-再灌注可导致心肌缺血性损伤加重，出现心肌纤维断裂、坏死，而HO?1的高表达可明显减少心肌纤维断裂及坏死，减轻灶性出血及炎性细胞浸润，有助于维持心肌细胞正常形态结构，对缺血-再灌注损伤心肌具有保护作用，其机制可能是通过多个环节的作用。
   
　　心肌缺血-再灌注时，产生大量的氧自由基，通过一系列过氧化反应，造成细胞结构损伤和功能障碍。缺血时，特别是再灌注后，氧自由基生成增加，而SOD等酶的清除能力有限，使生成与清除平衡失控，积累大量的氧自由基。并通过一系列过氧化反应，造成细胞结构损伤和功能代谢障碍。其中主要为细胞膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的过氧化，生成脂质过氧化物，再经过氧化物酶分解生成丙二醛（MDA），最终是磷脂结构发生变化，生物膜受到严重损伤。因此，通过测定脂质过氧化产物MDA的变化，可间接反映体内氧自由基代谢状况，它的高低反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是大分子生物酶，该酶可催化体内超氧化物自由基的歧化反应：2O·-2+2H+→H2O2+O2，清除超氧阴离子（O·-2），保护细胞免受损伤[6]，其活性高低可部分反映机体抗氧化系统的能力。有关研究发现，HO?1有抗氧化损伤能力，可增强组织对氧化应激性损伤的抵抗力[7～9]。因此，可测量心肌组织中MDA含量和SOD活性来反映HO?1对心肌缺血-再灌注损伤时心肌组织中氧自由基和抗氧化酶的影响。实验结果显示：在ZnPP组，HO?1抑制剂于再灌注前使用，使得HO?1活性受到抑制，与生理盐水组及CoPP组相比，心肌组织中MDA含量明显升高、心肌再灌注损伤进一步加重，表示为细胞坏死增加，说明缺血-再灌注后有大量自由基产生，攻击生物膜，引发脂质过氧化，产生大量丙二醛，由于自由基增多，使SOD消耗增多，显示活力下降。同时，CoPP组与生理盐水及ZnPP组相比，缺血-再灌注后，HO?1表达较生理盐水及ZnPP组高，细胞坏死少，心肌组织中MDA含量显著减少（P<0.01），而SOD活性明显升高（P<0.01），提示CoPP诱导的HO?1过表达具有心肌缺血-再灌注损伤的保护作用，其机制与抗氧化作用有关。第1期血红素氧合酶?1对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用研究  陆卫华，等

【】
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