乌司他丁复合氧氟沙星对大鼠肠黏膜二胺氧化酶的影响
作者：张福清，陈国忠，吴晓智，刘韧，聂海贵
【摘要】 目的 通过检测大鼠肠黏膜中的二胺氧化酶（DAO），来评价乌司他丁复合氧氟沙星对脓毒症大鼠肠黏膜的保护作用。方法 脓毒症大鼠80只，随机均分为四组：空白对照组（C组）、氧氟沙星组（O组）、乌司他丁组（U组）和氧氟沙星加乌司他丁组（O＋U组），每组再分为12 h 和24 h 两组。O组给予氧氟沙星8 mg/kg，U组给予乌司他丁15×104 U/kg，O＋U组则同时给予氧氟沙星8 mg/kg 和乌司他丁15×104U/kg，2次/d，连续2 d，C组给予生理盐水4 ml/kg 作为对照。在后24 h 和48 h 取大鼠肠组织检测DAO，观察肠黏膜DAO的变化情况。结果 肠组织DAO在治疗组中均明显升高， O组、U组与C组比较差异有统计学意义（P<0.05），O＋U组与C组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），O＋U组与O组、U组比较差异有统计学意义（P<0.05），O组与U组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 乌司他丁能保护肠黏膜的屏障功能，增加肠黏膜中DAO的活性，与抗感染药物合用效果更为明显。
【关键词】 乌司他丁；氧氟沙星；脓毒症；肠黏膜；二胺氧化酶
Abstract： Objective To evaluate the protection of ulinastatin combined with ofloxacin to diamine oxidase (DAO) of intestinal mucosa in pyemic rats.Methods A total of 80 septic rats were randomly divided into four sets equally: control group (Group C), ofloxacin group (Group O), ulinastatin group (Group U) , and ofloxacin and ulinastatin group [Group (O+U)], each of which was then divided into two sets (i.e. 12-hour group and 24-hour group). Ofloxacin was used with 8 mg/kg in Group O, ulinastatin was used with 15×104 u in Group U, and ofloxacin was used with 8 mg/kg and ulinastatin was used with 15×104 u at the same time in Group (O+U) twice a day for two days. Normal saline was used with 4 ml/kg in Group C. Rats’ intestinal mucosal samples were detected for DAO respectively after 24 and 48 hours' treatment in order that the variation of DAO would be observed.Results DAO was upgraded obviously in the three trial sets. There was significant difference between Group O or Group U and Group C (P<0.05), and more significant difference between Group (O+U) and Group C (P<0.01). Furthermore, there was significant difference between Group (O+U) and Group U or Group O (P<0.05), and there wasn’t significant difference between Group O and Group U (P>0.05). Conclusion Ulinastatin helps to protect the barrier function of intestinal mucosa, and to increase the activity of DAO in intestinal mucosa. The effect will be better when it is used in combination with anti?infective drugs.
Key words： ulinastatin; ofloxacin; sepsis; intestinal mucosa; diamine oxidase
二胺氧化酶(DAO)是人类和哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与黏膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，可反映小肠黏膜的完整性和损伤程度。乌司他丁(ulinastatin，UTI)是从人尿中提取精制的一种糖蛋白水解酶抑制剂,它能抑制多种酶的活性[1]。本研究采用公认的脓毒症动物模型—大鼠盲肠结扎穿孔模型（CLP），对大鼠肠组织中的二胺氧化酶进行检测，通过观察乌司他丁对肠黏膜组织中DAO的影响来明确乌司他丁对肠黏膜是否有保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型的制备与分组
由院上海实验动物中心提供的清洁级雄性近交系F344大鼠， 体重210～280 g，共80只，采用经典盲肠结扎穿孔法（CLP）制备脓毒症大鼠模型，将80只大鼠随机分为4组：空白对照组（C组，n＝20），氧氟沙星组（O组，n＝20），乌司他丁组（U组，n＝20），氧氟沙星＋乌司他丁组（O＋U组，n＝20），每组再分为12 h 和24 h 两组。各治疗组在制模6 h 后开始腹腔注射给药，2次/d，氧氟沙星组给予氧氟沙星8 mg/kg，乌司他丁组给予乌司他丁15×104 U/kg（UTI批号20061203广东天普生物化学制药有限公司生产），氧氟沙星＋乌司他丁组给予氧氟沙星8 mg/kg 和乌司他丁15×104 U/kg，空白对照组腹腔注射生理盐水4 ml/kg。
1.2 主要试剂
二胺氧化酶（DAO）试剂盒，美国Sigma公司；10%水合氯醛，福州总院药剂科。其余试剂均为国产或进口分析纯。
1.3 测定指标
各组动物在制模成功后经过治疗24 h 和48 h 后，分别在水合氯醛麻醉状态下，消毒后打开腹腔，取大鼠回肠组织标本检测DAO。将回肠组织从液氮中取出,称取200 mg 置于匀浆器中，加入7倍体积磷酸盐缓冲液(0.1 mol，pH=7.2)，冰浴匀浆后离心(10 000×g，30 min，4 ℃)，取匀浆上清液测DAO活性。
采用黎君友等[2]建立的改良DAO测定法（改良分光光度法）测定回肠组织DAO活性。严格按照试剂盒使用说明书进行操作。
1.4 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，将所有的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同一时间点内治疗组和对照组结果的两两比较时，采用单因素方差分析，对同组内不同时段的数据进行比较时，采用成组设计t检验。取α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。
2 结果
2.1 经过24 h 后取大鼠肠组织行DAO活性的检测，O组、U组、O＋U组DAO活性明显升高，C组DAO活性明显降低，O组、U组与C组比较差异有统计学意义（P<0.05），O＋U组与C组、O组、U组比较差异有显著统计学意义（P﹤0.01），O组和U组比较则差异无统计学意义，详见表1。
2.2 经过治疗48 h 后取大鼠肠组织行DAO活性的检测，O组、U组、O＋U组DAO活性继续升高，C组DAO活性继续降低，O组、U组和C组比较差异有统计学意义（P<0.05），O＋U组与C组、O组、U组比较差异有显著统计学意义（P﹤0.01），O组和U组比较则差异无统计学意义，详见表1。第1期乌司他丁复合氧氟沙星对大鼠肠黏膜二胺氧化酶的影响 张福清，等
2.3 DAO的两次检测结果两两比较，差异有统计学意义（P﹤0.05），详见表1。表1 四组大鼠24、48 h 肠组织中DAO活性的比较（略）
3 讨论
脓毒症是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重患者的
严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)的重要原因。脓毒症发病机制非常复杂，临床救治十分困难，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关，涉及机体多个系统功能改变[3]。
DAO在人和哺乳动物小肠黏膜上层绒毛上皮细胞中存在，其活性变化反映了小肠黏膜上皮细胞的结构和功能状况。当机体在应激状态下，存在由神经-内分泌介导的适应性反应，导致肠黏膜缺血、缺氧，上皮细胞膜及细胞间连接断裂，细胞坏死或凋亡，上皮从绒毛顶端开始脱落甚至黏膜全层脱落而形成溃疡[4]。同时，蓝斑-交感-肾上腺髓质系统激活，儿茶酚胺迅速升高，使肠系膜血管收缩，肠道微循环发生进一步变化，引起胃肠道血管灌注压下降，毛细血管血流缓慢，加重了肠黏膜的缺血性损伤，使细胞内释放DAO增加，使血中DAO活性随之升高，而肠组织内的DAO活性随之降低[5～6]。
众多研究[6～7]表明，脓毒症大鼠肠组织在内毒素、细胞因子等诸多因素影响下，肠黏膜会发生坏死脱落，细胞连接改变，炎性细胞浸润，肠组织中DAO活性发生改变，在24～48 h 达到高峰，我们选择这两个时间点作为本研究的观测时间点，可提高实验的灵敏度和对比性。
在本次实验中，通过对肠组织中DAO活性进行检测，观察到了小肠组织中DAO活性的改变，未经治疗的脓毒症大鼠小肠DAO活性明显下降，说明小肠黏膜完整性遭到破坏，肠黏膜屏障功能有严重受损，且一段时期内(48 h)仍不能恢复，这与隰建成等[6]的实验结果类似。这提示对脓毒症患者需要采取相应的保护肠黏膜的措施，能够改善肠组织中DAO活性，保护肠黏膜功能。
乌司他丁(ulinastatin，UTI)又叫尿抑制素，其前体是肝脏合成的inter?α胰蛋白酶抑制剂，本品属蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α糜蛋白酶等多种酶有抑制作用[8]； UTI具有稳定溶酶体和细胞膜及调控炎性介质和抑制氧自由基在体内的生成和释放作用[9～10]。药用乌司他丁最早被应用于临床治疗急性胰腺炎，现在被广泛应用于急性胰腺炎、创伤、急性循环衰竭和危重手术的治疗。杨连粤等[11]报道，脓毒症中肠黏膜通透性增加，UTI有减低脓毒症鼠肠黏膜损害和通透性增加的作用，多项动物试验研究也已证实UTI能够减少脓毒性休克动物的病死率 。
从本次实验结果中可以看出，治疗组和对照组的肠组织中DAO检测结果差异显著，经过乌司他丁加氧氟沙星治疗的大鼠明显优于其他三组，说明乌司他丁和氧氟沙星联合应用后抗应激作用更强、能减轻全身炎症反应、减轻脓毒症大鼠肠黏膜损害，从而有效保护肠黏膜的屏障功能，无论实验室检测指标还是预后，都得到明显改善。
【】
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