大肠癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127lo/-调节性T细胞的含量及临床意义

【摘要】  目的 探讨大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-调节性T细胞（Treg）的变化及意义。方法 流式细胞术检测36例大肠癌患者及30例健康人外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg的变化；ELISA检测同一标本血清中转化生长因子β（TGF-β）的表达水平。结果 36例大肠癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg占CD4+、淋巴细胞的比例为（6.92±1.31）%，与正常对照组（4.91±1.24）%相比差异有显著性（P<0.05）。20例腺癌、7例黏液癌、9例未分化癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例分别为(6.81±1.52) %、(6.99±1.21) %、( 7.08±1.17) %，各组间比较差异无显著性(P>0.05)，均高于对照组的(4.91±1.24)%，差异有显著性（P<0.05）。Ⅳ期大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg 高于Ⅱ期大肠癌患者（P<0.05）。大肠癌组外周血清中TGF-β水平显著高于正常对照组，随着TGF-β水平增加，CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例逐渐增高，两者呈正相关。结论 大肠癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg表达增高，与临床分期相关，但与组织学分类无关，导致机体免疫抑制，可能参与大肠癌发生。

【关键词】  大肠癌 CD4+、CD25+、CD127lo/-调节性T细胞 转化生长因子β

　　【Abstract】  Objective  To evaluate the changes of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells in peripheral blood from patients with colorectal carcinoma. Methods  36 patients with colorectal carcinoma and 30 healthy volunteers were included in this study. The proportion of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells population in CD4+ T cells was evaluated by flow cytometric analysis. The TGF-β production was measured by ELISA. Results  Patients with colorectal carcinoma had significantly higher percentages of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells than that of healthy controls (6.92±1.31% vs 4.91±1.24%, P<0.05), the proportion of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells in patients with adenocarcinoma (n= 20), mucinous carcinoma (n = 7) and undifferentiated carcinoma (n = 9) were all obviously higher than that of healthy controls(P<0.05), but there weren't obvious differences among the three groups of different pathological type (P>0. 05).The proportion of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells in the peripheral blood of 12 colorectal carcinoma patients with Ⅳ stages significantly higher than that of 8 colorectal carcinoma patients withⅡstages (7.23±1.34% vs 6.56±1.18%). Increased level of TGF-β was also detected in colorectal carcinoma patients, there was positive correlation between TGF-β level and the population of CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells (r=0.18, P<0.05). Conclutions  The CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells in the peripheral blood of colorectal carcinoma patients is significantly increased in comparison with that in healthy subjects and correlated with different stages. It may be responsible for immune suppression in colorectal carcinoma patients.

　　【Key words】  colorectal carcinoma  CD4+CD25+CD127lo/- regulatory T cells  TGF-β  

　　大肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，发病率呈上升趋势。最近的研究表明，CD4+、CD25+、Treg参与抑制免疫反应和维持机体的免疫耐受，并且与肿瘤免疫逃逸过程有着密切的联系，其分泌的转化生长因子(TGF-β)可能发挥了重要作用［１］。CD127（IL-7R）是新近发现的一种跟Treg细胞相关的抗原，其在Treg细胞上弱表达，而自身活化的记忆T细胞CD127强表达，两者能很好区分开来，因而现在一般用CD4+、CD25+、CD127lo/-来代表Treg［２，３］。Treg的表达与大肠癌关系的研究报道较少。本研究通过检测大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg的水平，探讨其在大肠癌患者免疫监视能力失调机制中的作用。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象
 
　　36例大肠癌患者为2006年2月至2007年11月住院患者，男21例，女15例；年龄36～72岁，平均（52±9.8）岁，均经病证实且不伴有自身免疫性疾病。病理组织学分型：腺癌20例，黏液癌7例，未分化癌9例。临床分期：Ⅱ期8例、Ⅲ期16例、Ⅳ期12例。另选性别、年龄相匹配的30例健康志愿者作为正常对照组。

　　1.2  主要试剂 

　　小鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PE-Cy5、mouse IgG1-FITC、mouse IgG1-PE (美国BD Pharmingen公司)；人TGF-β ELISA检测试剂盒(深圳晶美公司)。

　　1.3  标本处理 

　　采集患者及健康志愿者静脉血4ml，其中2ml用EDTA抗凝，流式细胞术分析，2ml分离出血清，保存于-80℃，ELISA检测。

　　1.4  流式细胞术检测 

　　2个流式试管，分别加入mouse IgG1-FITC/mouse IgG1-PE/CD4-PE-Cy5和CD25-FITC/CD127-PE/CD4-PE-Cy5、每管再加100μl抗凝全血，混匀，避光孵育30min，2ml溶血素溶血，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测，CellQuest v3.2软件获取及分析，外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg占CD4+、淋巴细胞比例。

　　1.5  TGF-β测定 

　　采用ELISA方法，按试剂盒说明操作。

　　1.6  统计学处理 

　　采用SPSS 13.0统计软件，数据用(x±s)表示，组间比较采用t检验，关联分析用线性相关分析。

　　2  结果

　　2.1  大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg表达 
　　36例大肠癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg占CD4+淋巴细胞的比例为（6.92±1.31）%，正常对照组为（4.91±1.24）%，两组差异有显著性（P<0.05）。

　　2.2   大肠癌不同组织学分型CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg和TGF-β的表达 

　　见表1。表1  不同组织学类型的大肠癌患者CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例和TGF-β检测结果比较(略)注：与正常对照组比较?P<0.05，??P<0.01

　　2.3  大肠癌临床不同分期间CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg和TGF-β的表达 

　　见表2。表2  不同临床分期的大肠癌患者CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例和TGF-β检测结果比较(略)注：与正常对照组比较?P<0.05，??P<0.01；与Ⅱ期比较△P<0.05

　　3  讨论

    CD4+、CD25+、Treg是具有免疫调节功能的T细胞亚群，研究表明，在胃癌、宫颈癌、肺癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤组织中存在高比例的CD4+、CD25+、Treg［４，5］，提示肿瘤的发生与免疫逃逸机制密切相关。Foxp 3是目前在小鼠和人Treg细胞中发现的最特异的标记［6，7］，但其表达在胞内，流式常规检测比较烦琐。最近研究表明，CD127分子在Treg细胞表面呈现低表达并且与Foxp 3的表达成负相关，因此用CD4+、CD25+、CD127lo/-可以很好的反映具有抑制作用的Treg亚群。CD4+、CD25+、Treg通过细胞直接接触或通过分泌调节性细胞因子，如IL-10和TGF-β等细胞因子发挥抑制免疫的效应，而细胞接触依赖性抑制作用的分子机制目前仍然不清楚。肿瘤患者体内CD4+、CD25+、Treg数量增加是肿瘤免疫抑制的机制之一。CD4+、CD25+、Treg通过抑制效应T细胞功能，在维持自身免疫耐受中发挥重要作用。

    本研究结果显示，36例大肠癌患者和30例健康志愿者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg占CD4+T淋巴细胞的比例分别为（6.92±1.31）%和（4.91±1.24）%、两者比较差异有显著性(P<0.05)。同时根据病理组织学分类，三种组织学类型大肠癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例差异无显著性（P>0.05），说明其与病理组织学类型无相关性。根据大肠癌病变的范围和是否发生淋巴结转移将大肠癌分为四期，分别检测外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例，结果显示，Ⅳ期大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg 高于Ⅱ期大肠癌患者（P<0.05），Ⅲ期患者与Ⅱ期及Ⅳ期患者差异均无显著性（P>0.05），但在一定程度上说明随着大肠癌病程的进展，CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg 数量逐渐增多，抑制免疫效应细胞应答，患者抗肿瘤免疫减弱，有利于肿瘤的生长和转移。有许多研究表明，肿瘤患者摘除肿瘤组织或化疗后体内的CD4+、CD25+、Treg降低［４］，因此，CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例可作为肿瘤患者免疫功能状态的一种客观标识，通过观察前后此类细胞比例的变化，辅助判断治疗是否有效。

    TGF-β是一种有效的免疫调节剂，Treg活化后产生大量的TGF-β，在体外能抑制大多数T、B细胞的增殖和分化［9］。TGF-β含量增加抑制免疫效应淋巴细胞的激活，直接导致机体免疫监视机制失效，无法清除突变的细胞，导致肿瘤的发生。有研究表明，CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg可以分泌抑制性细胞因子TGF-β，体外实验中激活的CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg能够与TGF-β特异性多克隆抗体结合从而阻断CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg的免疫抑制效应［１0］。本研究结果显示，大肠癌患者外周血TGF-β水平显著高于正常对照组，随着大肠癌患者外周血中CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg比例的增高，TGF-β浓度逐渐增加，两者呈正相关(r=0.18,P<0.05) 。TGF-β在大肠癌不同病理组织学分型及不同临床分期各组间比较差异无显著性。
        
    大肠癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg增多可能是导致机体免疫低下的原因之一，降低大肠癌患者体内CD4+、CD25+、CD127lo/-Treg或逆转其表型，增强机体免疫监视功能可为抗肿瘤免疫提供一种新的治疗途径。

【】
  　　1 Zhang L, Yi H, Xia XP, et al.Transforming growth factor-beta: an important role in CD4+、CD25+、 regulatory T cells and immune tolerance. Autoimmunity, 2006, 39(4):269～276.

　　2 Seddiki N, Santner-Nanan B, Martinson J, et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med, 2006, 203(7):1693～1700.

　　3 Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+、 T reg cells. J Exp Med，2006,203(7):1701～1711.

　　4 章圣辉，韩义香，吴建波，等. 子宫颈癌患者外周血CD4+、CD25+、CD127lo/-调节性T淋巴细胞的含量及肿瘤免疫水平检测. 中华妇产科杂志，2007，42(6): 419～420.

　　5 Sasada T, Kimura M, Yoshida Y, et al. CD4+、CD25+、 regulatory T cells in patients with gastrointestinal malignancies: possible involvement of regulatory T cells in disease progression. Cancer, 2003, 98(5): 1089～1099.

　　6 Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of CD4+、CD25+、 regulatory T cells. Nat Immunol, 2003, 4(4):330～336.

　　7 Wang HY, Lee DA, Peng G, et al. Tumor-specific human CD4+、 regulatory T cells and their ligands: implication for immunotherapy. Immunity, 2004, 20(1):107-118.

　　8 刘俊田，岳杰，任秀宝，等. 乳腺癌患者外周血CD4+、CD25+、调节性T细胞的检测及意义. 中华肿瘤杂志，2005，27（7）：423～425.

　　9 Wan YY, Flavell RA. Regulatory T cells, transforming growth factor-beta, and immune suppression. Proc Am Thorac Soc, 2007,4(3):271～276.