子痫前期外周血免疫相关基因的差异表达

                    作者：孙波 郑桂琴 赵卫华 高素清 张为远

【摘要】  目的 了解子痫前期患者外周血免疫相关基因的差异表达，探索其与子痫前期发病的关系。方法 选择4例重度子痫前期患者为研究对象，以4例正常妊娠妇女为对照，应用基因芯片技术检测两组孕妇外周血差异基因表达谱，了解子痫前期外周血免疫相关基因的异常表达。结果 在所检测的21000个基因中，出现2次重复一致差异表达的免疫相关基因共有33个，子痫前期组差异表达上调基因23个，下调基因10个。结论 免疫相关基因的差异表达可能是子痫前期发病的原因之一。

【关键词】  子痫前期 差异表达 寡核苷酸序列分析 基因 免疫

　【Abstract】Objective  To investigate the differential expression of immunity-related genes in peripheral blood leucocytes between preeclampsia and normal pregnancy cases, and to explore the pathogenesis of preeclampsia. Method  The differential gene expression files of 4 severe preeclampsia and 4 normal pregnancy cases were studied using cDNA array technique in order to identify the differential expression of immunity-related genes. Results  33 differentially expressed immunity-related genes had the concordance in at least 2 cases among total 21000 genes. 23 genes were up-regulated and 10 were down-regulated. Conclusions  Differential expression of immunity-related genes in peripheral leucocytes from preeclampsia may be responsible for the molecular mechanism of preeclampsia .

　　【Key words】Preeclampsia  Differential expression  Oligonucleotide array sequence analysis  Gene  Immunity   

　　子痫前期是一种常见的妊娠并发症，是导致孕产妇和围生儿死亡的重要原因之一，其病因及发病机制至今仍未完全阐明。已有的大量研究表明免疫因素在子痫前期的发病中起重要作用。作者自2007年7月至2008年7月应用基因微阵列技术对子痫前期外周血白细胞基因进行平行、大规模、高通量的分析，了解子痫前期患者外周血免疫相关基因表达的变化，以寻找差异基因与子痫前期发病机制之间可能的内在联系。现报告如下。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象 

　　选择重度子痫前期患者4例为研究对象，子痫前期的诊断标准依照乐杰主编《妇产》第六版的标准。选择4例同期正常妊娠妇女为对照组，无妊娠期高血压病史及家族史。两组孕妇均为汉族妇女，单胎初孕妇，年龄、孕周、职业分布均衡，体重指数接近，无糖尿病、原发性高血压病史，无风湿、类风湿、红斑狼疮等自身免疫相关疾病，排除心、肝、肾及甲状腺疾病。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 外周血白细胞的分离 

　　提取病例组及对照组肘静脉新鲜全血15ml，立即用EDTA抗凝。离心弃去血浆后再加淋巴分离液，移液器收集界面上的白细胞层，离心弃上清可见白色的沉淀，加入Trizol试剂，用移液器充分抽打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体。

　　1.2.2  细胞总RNA的抽提与鉴定 

　　Trizol法抽提细胞总RNA，样品经紫外分光光度计检测A230、A260、A280值，甲醛变性胶电泳检测28S、18S条带变化，鉴定样品质量是否符合表达谱芯片的实验要求。

　　1.2.3  对样品RNA进行荧光标记 

　　双链cDNA的合成与纯化，以cDNA为模板用随机引物和Klenow酶进行DNA链的标记，并在DNA链延伸过程中掺入荧光素。

　　1.2.4  杂交与清洗 

　　将标记的DNA溶于杂交液中42℃杂交过夜，清洗后玻片甩干即可用于扫描。

　　1.2.5  信号扫描和分析 

　　芯片用ScanArray Express双通道激光扫描仪进行扫描，分别得到子痫前期外周血cDNA的Cy5图像文件和正常妊娠外周血的Cy3图像文件。采用GenePix Pro 4.0图像分析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化；最后以差异为两倍的标准来确定差异表达基因。比值>2.0表示子痫前期外周血基因表达水平高于正常妊娠，比值<0.5则显示子痫前期外周血基因表达水平低于正常妊娠。

　　2  结果

　　2.1  总RNA抽提与鉴定结果 

　　样本的总RNA经紫外分光A230、A260、A280测定，甲醛变性胶电泳检验RNA样品质量符合表达谱芯片实验要求。OD260/OD280值为1.714～1.965，均介于1.7～2.1之间。结果显示总RNA无降解，28S、18S条带清晰，28S比18S的亮度接近2∶1，提示得到高纯化的总RNA。

　　2.2  基因表达谱芯片杂交结果 

　　图1和图2均为Cy5荧光标记的子痫前期外周血白细胞cDNA杂交扫描图像与Cy3荧光标记的正常妊娠外周血白细胞cDNA杂交扫描图像的叠加图像。在图像中，如果Cy3信号较强，该点呈绿色，表示该基因呈下调趋势；如果Cy5信号较强，该点呈红色，表示该基因呈上调趋势。在两种外周血中表达水平相当的显黄色，而均不表达的则为无色。图1显示肿瘤坏死因子（TNF-α）在子痫前期外周血表达增高，Cy5信号较强，呈红色。图2显示白介素-4受体（IL4R）在子痫前期外周血表达降低，Cy3信号较强，呈绿色。

　　2.3  免疫相关基因的差异表达结果分析 

　　用高通量基因表达谱芯片筛选子痫前期组和正常妊娠对照组外周血免疫相关的差异表达基因，其中重复2次差异表达的基因共33个，子痫前期组差异表达上调基因23个，见表1，下调基因10个，见表2。表1  子痫前期外周血表达增高的免疫相关基因（略）表2  子痫前期外周血表达降低的免疫相关基因（略）

　　3 讨论

    近代生殖免疫学说认为妊娠是一种成功的半同种移植，其成功有赖于胎-母间免疫平衡，而这种平衡一旦失调就可能引起免疫排斥反应，导致病理妊娠-子痫前期，免疫机制在子痫前期发病机制中的作用已得到广泛的证实。近年来，新兴的生物芯片技术特别是基因芯片技术的应用为子痫前期生物基因信息的大规模检测提供了优良条件［1，2］，为子痫前期的基因研究提供了新的思路和方法［1，3］。作者采用基因表达谱芯片所发现的子痫前期差异表达基因中，33个与免疫病理相关。这些基因表达的变化可能参与了子痫前期发生、的病理生理过程，是免疫异常的分子基础。

    妊娠期间母体通过复杂的细胞因子对整个妊娠过程进行免疫调节。其中以Thl/Th2细胞因子在妊娠过程中的免疫调节作用尤为引人注目。作者所发现的子痫前期免疫相关基因中，共有8个基因的表达与Th1/Th2相关，一些基因表达反应性增高或降低，以调节细胞因子在子痫前期外周血中的水平。这些基因包括IL2RG（NM_000206）、IL4（NM_000589）、IL4R（NM_000418）、IL6R（NM_000565）、IL10（NM_000572）、TNF-α（NM_000594）、IFN-γ（NM_000619）、TGFBR1（NM_004612）。其中，IL-2R、TNF-α等Th1类细胞因子在子痫前期患者外周血表达增高，而IL-4、IL-10等Th2类细胞因子表达则降低。Th1类细胞因子异常增多，Th1/Th2比率上升，免疫排斥反应增强，可造成子痫前期的一系列临床症状［4，5］。
   
　　趋化性细胞因子又叫趋化因子或趋化蛋白，多种趋化性细胞因子及其受体是调节免疫反应的重要分子，它们的存在和变化对Th1/Th2细胞的分化和极化具有重要作用。在基因芯片筛选得到的33个免疫相关基因中，有12个为趋化性细胞因子的差异表达基因，其中白介素-8(IL-8，CXCL8)、内皮细胞衍生中性细胞趋化剂-78(ENA-78，CXCL5)、生长相关因子(GRO，CXCL1、CXCL2)、巨噬细胞炎症蛋白-α(MIP-α，CCL3)、巨噬细胞炎症蛋白-β(MIP-β，CCL4)、IP-10、CCR1等在子痫前期外周血中呈高表达，而CCR3、CCR4、CCL17则呈低表达。作者认为单一的趋化因子水平不能代表整个免疫应答状态，趋化因子和Thl/Th2细胞极化之间存在着一系列的免疫动态平衡，子痫前期患者MIP-1α及其受体CCR1、MIP-1β、IP-10表达明显增高，CCR3及其配体CCL17、CCR4表达明显降低，Th1细胞被激活,分泌大量IL-2、IFN-γ、和TNF-α等细胞因子，而IL-4、IL-10等Th2细胞因子分泌减少，免疫排斥反应增强，引发子痫前期一系列病理反应。

    国内外多数研究证实子痫前期患者血清免疫复合物增加［6，7］，过量免疫复合物沉积于肾或胎盘血管内，通过经典途径激活补体，进而损伤血管内皮细胞，研究表明子痫前期的补体系统处于激活状态，补体裂解产物C3a增加，伴随着补体C3水平下降［8］，本实验结果与以上研究结果一致。其他免疫相关基因如杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR2DL4、ZAP-70及活化性膜受体CD226、T细胞的活化辅助分子CD80以及SCYA23、CEACAM6等在子痫前期外周血中亦呈现异常表达，这些差异表达基因可能在子痫前期的发生、发展过程中起一定作用。总之，子痫前期的免疫病理过程并不是单一基因或蛋白质的异常，而可能涉及一系列基因和蛋白的变化，免疫相关基因的差异表达可能是子痫前期发病的原因之一。

【】
  　　1 Granger JP, Alexander BT, Llinas MT, et al. Pathophysiology of hypertension during preeclampsia linking placental ischemia with endothelial dysfunction. Hypertension,2001,38:718～722.

　　2 Reimer T, Koczan D, Gerber B, et al. Microarray analysis of differentially expressed genes in placental tissue of pre-eclampsia: up-regulation of obesity-related genes. Mol Hum Reprod,2002,8:674～680.

　　3 Nagy B, Rigo JJ, Fintor L, et al. Apolipoprotein E alleles in women with severe pre-eclampsia. J Clin Pathol,1998,51:324～325.

　　4 Li L, Elliott JF, Mosmann TR. IL-l0 inhibits cytokine production vascular leakage and swelling during Thelper l cell-induced delayed-type hypersensitivity. J lmmunol,1994,153(9):3967～3978.

　　5 Alexander BT, Cockrell KL, Massey MB, et al. Tumor necrosis factor alpha induced hypertension in pregnant rats results in decreased renal neuronal nitric oxide synthase expression. Am J Hypertens,2002,15(2Pt1):170～175.

　　6 Jain A, Rohatgi P, Singh VK, et al. Circulating immune complex in pre-eclampsia. J Indian Med Assoc,1991,89(9):251～253.

　　7 Starostina TA, Belokrinitskii DV, Kudriashova NM, et al. Circulating immune complex and immunoglobulins A, M and G in the motherfetus system in normal pregnancy and gestosis. Asush Ginekol Mosk,1992,(1):19～22.

　　8 Abramson SB, Buyon JP. Activation of the complement pathway comparison of normal pregnancy, preeclampsia and systemic lupus erythematosus during pregnancy. Am J Reprod Immunol,1992,28(3～4):183～187.