人类乳头状病毒(HPV)的检测及其临床应用

【关键词】  人类乳头状病毒 HPV 临床应用
　　    人类乳突状病毒 (HPV) 的感染普遍流行于世界各地，经由病毒 DNA序列比对，可鉴定出超过 200 种以上的HPV亚型。HPV 病毒能引起人类及动物的感染，主要感染宿主的上皮细胞和组织内层。依感染组织型态可区分为表皮型和粘膜型两种：表皮型主要是引起手、脚上皮感染；粘膜型则造成口腔、喉咙、呼吸道及生殖泌尿道感染。HPV会引起手、脚皮肤疣的产生（如：扁平疣、寻常疣、跖疣…等），主要是引起皮肤角质增生，通常1～5年后患处会缓解，但部份感染脸部也会引起皮肤癌，有些也会引起口腔的鳞状细胞癌。HPV 的感染是造成子宫颈癌的主因之一，其感染途径普遍是藉由性行为引起，然而经由母体的垂直感染也是造成 HPV感染的途径之一。在临床上,根据HPV亚型致病力大小或致癌危险性大小不同，可将HPV分为低危型、高危型两大类。表1   HPV亚型及相关临床病变表2   低危型、高危型HPV亚型及相关临床病变

    1  致癌性

    HPV是环状之双股DNA病毒，基因组大小将近 7900bp，依基因功能可分为三大主要基因部份：①上游调控区，具调控、转录的功能；②早期区,此部份包含了E1、E2、E4、E5、E6、E7等基因，其具有复制和致癌性蛋白的产生；③晚期区,此部份包含L1、L2主要的构造蛋白,形成病毒的外套。E6、E7的基因产物会结合上RB及P53 等抑癌蛋白上，因而降解了抑癌功能，打乱了细胞正常的生长调控功能并增加基因之不稳定性.持续累积的宿主修护错误，将引发癌症［1］。

    HPV的流行病学研究指出：因 HPV 对热及干燥具有抗性，因此更增加其感染性，HPV 的感染要藉着性行为及皮肤间亲密的接触行为而造成感染，接触到感染者的衣物也会致病。于感染的龄层调查中发现，主要感染的年龄为18～30岁的人，于子宫颈癌的患者中主要都是 35 岁以上的人，因个体于年轻时感染，而后渐渐病情加重以致引起癌症产生。虽然高危险群的 HPV分型角色是非常重要的，但也必须辅以更多的危险因子，才足以产生癌症［2］。

    HPV 基因上游的调控序列有相似于固醇类的接受点，因此 HPV 感染患者中，使用固醇类者可能加剧癌化的产生，对于香烟或致癌物的接触，也是重要的危险因子。部份可藉由性行为感染的病毒如：疱疹病毒（HSV）、巨细胞病毒（CMV）等，都可能于形成癌症的过程中扮演协同的作用。

    HPV 感染病毒量的产生可能也是致癌的重要因子，学者藉由定量分析高危险型中之16、18、31、33、45 型和低危险型之 6、16 型，研究中发现：HPV16 型能产生较高的病毒量，这也是导致癌化的因子，但部份的证据显示，许多低表现病毒量的高危险型 HPV，仍能引发严重的癌症反应。

    另一造成癌化的重要因子，即是病毒本身的变异性，例如：不同地区流行的HPV16型，可因地域不同而演化出不同病毒株。利用基因演化树可区分出欧洲株（European，E）、亚洲株（Asian，As）、亚洲－美洲株（Asia?American，AA）、非洲 1 株（African?1，Af1）、非洲 2 株（African?2，Af2）。因为HPV基因上之LCR、E2、E6、E7序列之不同，可引起生物和化学反应上不同程度的转录、调控，也使得病情有显着的差异。例如：亚洲?美洲株就比欧洲株就有较高的致癌性，而原始欧洲株于LCR基因上的变异结果就产生了 46 株新的欧洲病毒株，其更具有转录效能。

    部份非病毒的影响也是造成癌症产生的重要因子，例如：宿主 HLA 及 P53 的表现影响。宿主基因遗传的易感受性，约占癌症产生之 2.7％之影响性。针对 HPV 的初期免疫机转，主要是靠着宿主细胞免疫反应，个体基因的组成影响了 HPV 的易感受性及 HPV 之清除能力及感染后癌症的时间。相关研究也显示，感染患者中超过了 39％的人会有多重病毒株的感染情形，这种现象更是加重引发癌症的因子。

   2  感染症状

    经由性行为产生的 HPV 感染，可能产生3种结果：①新生的湿疣，即是环绕于生殖道、腔门口的湿疣(俗称菜花)，通常为 HPV?6、HPV?11 型感染所引起，一般不会引发癌症，有些人于感染后3～4个月得到缓解，而也有不少人会增加疣的数目或大小形态的改变。主要的方式为冷冻剥离、电烧切除或以化学药水于患处涂抹；②有部份的人感染 HPV 后，会有迟发或不明显症状，于宫颈刮片上的细胞形态仍属正常，但已经有 HPV DNA 的表现，常见为较低危型的 HPV 感染；③为较活动型的感染，常见于高危型 HPV引起，包括生殖泌尿道上皮鳞状细胞的损伤，也可能引发癌症的产生，通常以 HPV?16、58和18 型为主。

    3  临床检测

    3.1  细胞学检查

    是利用宫颈刮片细胞学检查或液基薄层细胞学检查(目前改良的自动化细胞学检查方法),藉由细胞外观形态的转变来加以诊断,镜下可见挖空细胞、角化不良及湿疣外底层细胞.因其局限性,细胞学诊断HPV感染敏感性较差.国内学者回顾性分析了因细胞学检查异常而行阴道镜下多点取材作病理切片检查的374例患者的临床资料,发现经细胞学筛查HPV感染率为28.3%［3］。

    3.2  病检查

    HPV感染宿主的上皮组织从而导致形态学改变,其病理学表现包括鳞状上皮呈疣状或乳头状增生,常伴有上皮脚延长、增宽呈假上皮瘤样增生;表皮角化不全,常伴角化不全层核肥大,显示一定的非典型性;棘层不同程度增厚;基底细胞增生,层次增加;中表层出现灶状分布的挖空细胞等［4］。对形态学表现不典型者,可作免疫组化或采用原位杂交技术进一步检测HPV。

    3.3  免疫组化检测

    免疫组化是通过检测HPV的衣壳抗原来进一步明确HPV感染,其所得阳性反应定位明确,判断可靠.但是,必须在HPV?DNA复制成熟后才有衣壳装备.阴性者也不能否定诊断,该方法敏感性较低.李雯等用免疫组化法检测95例尖锐湿疣患者,HPV阳性率仅为63.1%［5］。

    3.4  原位杂交反应（In situ hybridization）

    最直接的细胞诊断是于细胞中染出 HPV，目前已有相关组织免疫学技术应用在 HPV 的诊断，其原理是以核酸探针进行原位杂交反应，以鉴定出高危险群之 HPV。组织病的检查，也可採用阴道镜观察或直接採集病灶样本，病灶上的组织利用专一性抗体进行探针测试。

    3.5  HPV DNA的直接检测

    利用专一的分型引子（primer）进行 PCR 反应，可区分出各型的高危险型 HPV 感染或低危险型的感染，其分析敏感度可达 10 至 200 个 HPV 的 copy 数，但其缺点是 HPV 的分型太多，必须针对各分型的操作，因此有相对的复杂性存在，而且部份的研究指出，有些 HPV 基因的变异会导致 PCR无法检测出来，也有少数研究指出因 HPV 的基因融合于肿瘤组织中，使得 PCR的反应也无法顺利检出。相关分子技术如：限制酶反应或line probe 的技术也被运用，但都有类似的缺点存在［6］。

    3.6   增幅杂交反应

    目前美国食品药物管制局已核准相关杂交反应检查套组，运用于 HPV 的检测。其原理是运用核酸探针杂交到受测检体之 HPV DNA 上，再以增幅的讯号以化学萤光或酵素反应侦测，其主要分两种探针组合：探针组合 A，包括低危险型的 HPV 核酸探针主要确认 HPV?6、11、42、43、44；而探针组合B,包括高危险型的 HPV 探针组合，如：HPV?16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等，使用上很方便，可用于初步 HPV 的筛检，但是却无法针对 HPV确定的分型。

    3.7   HPV mRNA的检测

    HPV mRNA 的表现可以适度的反应 HPV的病毒量，因此临床上有其检测的重要性，利用自动化的仪器如：化学萤光分析或流式细胞仪（flow cytometry），都可用于 HPV 的病毒量检测。

    3.8  微阵列分析（micro array）

    目前已有生技公司利用微阵列技术，将 HPV的各分型的探针固着于玻片上，再以受测检验的 DNA进行杂交反应，并以仪器分析出为那一型 HPV 的感染，运用上将较其它方法快速、便利，唯价格上仍较为高。

    4 

    HPV 的治疗可依 HPV 造成的细胞伤害采取不同的治疗方式，临床医师可因病情的不同施行不同程度的治疗［7］。初期的感染可能有 HPV 的阳性反应，但无病灶的形成，可建议于 12 个月再复诊。如开始有病灶或细胞损伤的情形发生时，可建议 4 至 6个月复诊，或直接于门诊采取冷冻、电烧、雷射、LEEP刀的方式切除病灶治疗，并注意是否有转移情况，手术后的追踪是非常重要的。

    5  预防

    宫颈刮片和液基薄层细胞学检查是普遍的预防方法，但持续的追踪才能达到预防的效果，配合HPV分子生物的检测方式也能提供良好的早期检测。目前已有多方研究，利用 HPV 之伪病颗粒（Virus?like particles，VLP）进行疫苗的试验，实验中证实：VLP 产生的蛋白可以产生良好的免疫效果。但因 HPV 有太多分型，于 VLP 产生的免疫力又有其分型之专一性，所以无法产生良好的交叉反应，因此未来疫苗的研发，必须考虑地域流行毒株或多株疫苗的特性及有效性。

    上述几项检测方式，相关细胞学一般的检测方式于敏感度较为不足，但确有其确认诊断的重要性，藉由分子生物的技术将可大大提高敏感度。虽然各种检验方式于使用上有不同的专一性和敏感性但配合临床症状的诊断将能提早确认疾病的产生，也能达到早期治疗的效果。

【】
  1 Steller, M. A. Human papillomavirus, it's genes...and cancer vaccines. Cancer Cell, 2003,3:7～8.

2 Burd, E. M. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin. Microbiol. Rev,2003, 16:1～17.

3 金力，王友芳，等．子宫颈上皮内瘤变筛查方法的综合评价. 中华妇产科杂志, 2002,37:157～158.

4 廖松林,高子芬. 尖锐湿疣的病理诊断. 中华病理学杂志, 1990,19(2):151～152.

5 李雯，陈金培，等. 原位杂交与免疫组化技术在HPV检测中的应用. 广州医学院学报，2004,32:63～65.

6 Hubbard, R. A. Human papillomavirus testing methods. Arch. Pathol. Lab Med, 2003,127:940～945.

7 Lozano, R. Successfully integrating human papillomavirus testing into your practice. Arch.Pathol .Lab Med, 2003,127:991～994.