比较雷米普利与卡托普利对糖尿病大鼠心肌间质重构的影响

                     作者：姚红梅 熊世熙 宋陈芳

【摘要】  目的：通过观察雷米普利与卡托普利对糖尿病大鼠心脏指数、心肌局部血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、Caspase?3蛋白阳性染色指数、心肌细胞凋亡指数（AI）的影响，探讨两者对糖尿病大鼠心肌病的可能保护机制。 方法：40只健康雄性SD大鼠随机分为10只正常对照组和30只糖尿病组，糖尿病组用链脲佐菌素（STZ）注射建模，成功后随机分为糖尿病未组（糖尿病对照组）、雷米普利治疗组和卡托普利治疗组，每组10只。治疗组按药品说明书的推荐以雷米普利 2.5mg/(kg.d)水溶液灌胃，卡托普利 50mg/（kg.d）水溶液灌胃，正常对照组和糖尿病对照组每天以同等体积生理盐水灌胃。给药9周后，麻醉处死动物，放射免疫法测定心肌局部AngⅡ的含量，ABC免疫组化法检测Caspase?3蛋白阳性染色指数，免疫组化法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量。 结果：与正常对照组相比，糖尿病对照组与治疗组心脏指数均增大（P<0.05），AngⅡ含量显著升高（P<0.05）, 心肌细胞凋亡指数（AI）明显增高（P<0.05）,Caspase?3 蛋白阳性染色指数也增高（P<0.05）；用雷米普利和卡托普利治疗后，上述指标均有显著改善，雷米普利组较卡托普利组心脏指数、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量改善不明显（P<0.05）,其余指标两组比较没有统计学差别（P>0.05）。结论： 糖尿病心肌病中心肌间质有重构现象发生，雷米普利与卡托普利均可以通过降低AngⅡ、Caspase?3阳性蛋白指数来改善心脏的功能，而且两组相比稍有差别。

【关键词】  糖尿病心肌病； 间质重构； 雷米普利； 卡托普利； AngⅡ； Caspase?3

 糖尿病心肌病这个观点已经得到实验的证实，但对于糖尿病心肌病的发生机制并不完全明了。本研究使用非降糖药血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利、卡托普利对糖尿病性心肌病进行干预，比较两药对糖尿病心肌病心肌间质的保护作用，为临床治疗提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  主要试剂  链脲佐菌素(STZ)为美国Sigma公司产品，免疫组化抗体购自晶美生物技术公司,AngⅡ放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

    1.1.2  动物分组  健康雄性SD大鼠36只，体重210～250g,平均（227±10）g,购自武汉大学动物实验中心。随机分为正常对照组（9只）和糖尿病组（27只），喂养一周后，糖尿病组禁食10h,一次性腹腔注射STZ (用枸橼酸钠缓冲液溶解，pH =4．5)50mg/kg，正常对照组注射同等剂量的枸橼酸钠缓冲液，72小时断尾后测血糖值及尿糖定性， 尿糖定性≥ +++ ，空腹血糖持续3天≥13.8mmol／L(250mg／d1)，动物进食、进水、尿量增加，为糖尿病大鼠模型。然后再随机分为糖尿病对照组、雷米普利治疗组、卡托普利治疗组，每组9只，4组大鼠继续以原饲料喂养8周，每周测空腹血糖一次，监测血糖的变化。

    1.2  方法

    1.2.1  取材  禁食10 h ,每只动物称取体重（BW）后,乙醚麻醉,解剖后迅速取出心脏, 称心脏(HW) 和左心室(含室间隔LVW)重量。以HW/BW为心脏指数（mg/g）,取部分左室心肌组织甲醛固定，免疫组化法测Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。

    1.2.2  放射免疫法检测AngⅡ含量  取新鲜标本100mg,采用AngⅡ放射免疫试剂盒，按照说明测定AngⅡ的含量。

    1.2.3  心肌组织免疫组织化学检测  用于Ⅰ型、Ⅲ型胶原的检测。采用石蜡切片,切片厚4μm抗原染色,按染色试剂说明书进行操作,于显微镜下观察。每张切片随机选取5个视野,采用高清晰彩色图文报告分析系统分析,以5个光密度值(OD值)的平均值作为各标本的蛋白表达。

    1.2.4  原位心肌细胞凋亡的检测  左心室前壁心肌常规制作组织切片，每张玻片上摊5个组织片，然后按原位细胞凋亡试剂盒的说明，检测凋亡细胞切片。常规二甲苯脱蜡、下行梯度酒精脱水，蛋白酶K消化，37℃湿盒内孵育，PBS洗3次，37℃湿盒内4%小牛血清封阻非特异性反应，滴加POD置37℃湿盒内孵育，PBS洗3次，DAB染色，自来水终止反应，苏木精复染，脱水、透明、封片。

    凋亡细胞阳性指数：根据凋亡阳性细胞的分布情况，每张切片于光镜下随机选择5个无重叠视野，每视野计数300个心肌细胞中的阳性细胞核数，以平均计数阳性细胞核数所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(apoptosis index, AI)。

    1.2.5  Caspase?3阳性蛋白表达率检测  石蜡包埋切片后按ABC试剂盒说明书操作。免疫组化染色胞浆或胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，以平均计数阳性细胞核数所占的百分比作为caspases?3阳性蛋白表达率。

    1.3  统计学分析

    各参数均以 ±s表示,采用SPSS13 .0统计软件,组间参数比较采用方差分析，规定P<0.05说明差异有统计学意义。

    2  结果

    27只糖尿病大鼠均建模成功，实验过程中糖尿病大鼠与正常对照组相比，活动明显减少，多饮、多尿、多食，血糖值稳定。实验过程中因感染，糖尿病对照组、雷米普利组各死亡1只。死亡动物未纳入统计学分析。

    2.1  4组大鼠心脏指数、体重、胶原含量的比较

    与正常对照组相比，糖尿病未组、雷米普利组、卡托普利组试验结束时体重明显减轻（P<0.05）, Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达增多（P<0.05）,说明存在心肌间质重构。糖尿病未治疗组、雷米普利组心脏指数升高（P<0.05）；与糖尿病对照组相比较，卡托普利组体重减轻明显（P<0.05）,雷米普利组与卡托普利组的心脏指数、Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达均有明显变化（P<0.05）。见表1。表1  4组体重、心脏指数、胶原含量比较注：* 表示与N相比，差异有显著性（P<0.05）；# 表示与DM相比，差异有显著性（P<0.05）。

    治疗后卡托普利组较糖尿病对照组体重无显著性增加（P>0.05）,轻于雷米普利组（P<0.05）。卡托普利组心脏指数高于雷米普利组（P<0.05）。卡托普利组较雷米普利组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的含量增高（P<0.05）。

    2.2  4组血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、AI、Caspase?3蛋白阳性染色指数的比较

    与正常对照组相比，糖尿病未治疗组、雷米普利组、卡托普利组AngⅡ、AI、Caspase?3蛋白阳性染色指数均增加明显（P<0.05）；与糖尿病组相比，雷米普利组和卡托普利组AngⅡ、AI、Caspase?3蛋白阳性染色指数均降低（P<0.05）。见表2。表2  四组AngⅡ含量、AI和Caspase?3蛋白阳性染色指数比较注：* 与N相比，差异有显著性（P<0.05）；与DM相比，差异有显著性（P<0.05）。

    治疗后组间比较：雷米普利组与卡托普利组之间在AngⅡ含量、心肌细胞凋亡指数（AI）、Caspase?3蛋白阳性染色指数方面差别不明显，都没有统计学意义（P>0.05）。

    3  讨论

    糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy ）是指由糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死等损害。糖尿病心肌病通常表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻为主的心室功能异常,可诱发心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死［1］。最近的研究表明，糖尿病心肌病存在心肌间质重构现象，是由于心脏成纤维细胞的过度增生，导致细胞外基质质和量的变化［2］。曹萍等的研究发现糖尿病大鼠心肌组织中不仅LN、FN含量增加，而且CL含量也增加明显，证明在糖尿病心肌组织中确实存在ECM 的积聚［3］。我们的实验结果也表明，作为细胞外基质重要组分的Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量也明显增多，说明在糖尿病心肌病的病变过程中有间质重构现象的发生。

    在糖尿病早期已增高的AngⅡ即可通过下调成纤维细胞的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27，影响细胞周期，直接刺激心肌成纤维细胞的增值，使成纤维细胞DNA和蛋白的合成增加而导致心肌纤维化［4］。Frustaci［5］等对糖尿病合并有高血压的患者的心肌进行了活检，结果发现，糖尿病可上调RAS，AngⅡ可引起心肌氧化性损伤，最终导致心肌细胞凋亡和坏死。这说明心肌细胞的凋亡也参与了糖尿病心肌病的病变过程之中。而在心肌细胞凋亡的过程中，Caspase?3蛋白被认为是凋亡过程的主要执行者，是凋亡过程的关键部分［6］。但是关于凋亡在间质重构中的作用的研究还比较少，我们的实验在成功建立了糖尿病模型后，目的就是探讨凋亡过程在心肌间质重构中的可能作用以及两类ACEI类药物对其的影响。结果发现，在糖尿病组中，AI、Caspase?3蛋白阳性染色指数以及AngⅡ的含量均增多，提示凋亡过程参与了心肌间质的重构过程，而且可能与AngⅡ的含量有关，AngⅡ可能直接或者间接影响了凋亡过程，从而导致了心肌间质重构的发生，为糖尿病心肌病的治疗提供了一条崭新的方向，为临床治疗提供了理论上的支持。

    非降糖药血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利与卡托普利治疗后，心脏指数、AngⅡ含量、心肌细胞凋亡指数（AI）以及Caspase?3蛋白阳性染色指数均降低，表明雷米普利和卡托普利均可以通过抑制AngⅡ来抑制细胞凋亡在糖尿病心肌间质重构中的作用；但是，卡托普利组在减少胶原表达方面与雷米普利组相比，效果稍差些，这可能与不同类别的血管紧张素转换酶抑制剂对ACE的抑制作用强弱不同强弱不同有关。

【】
  1 张宝生,张宏.糖尿病心肌病发病机制的研究进展.临床荟萃，2006，13：968～970.

2 Searls YM,Smirnova IV,Fegley BR,et al.Med Sel Sports Exere,2004，36(11)：1863～1870.

3 曹萍, 刘铭球, 熊世熙，等. 福辛普利对实验性糖尿病大鼠心肌细胞外基质的影响. 第四军医大学学报，2002 ; 23 (9) : 619～622.

4 周艳芳，黄培春，鲍波.血管紧张素Ⅱ对心肌成纤维细胞增殖及p21，p2表达的影响.实用医学杂志，2005，21（11）：1129～1131.

5 Frustaci A,Kajstura J, Chimenti C,et al, Myocardial cell death in human diabetes, Circ Res，2000，87(12):1123～1132.

6 Jin ZY, El?Deiry WS ，Overview of cell death signaling pathways ，Cancer biology and therapy , 2005,4 (2): 139～163.