前列地尔对局灶性脑缺血大鼠脑组织p53的影响
作者：包翠芬 包翠芳 田布先 闵连秋
【摘要】 目的：从脑组织p53的表达变化的角度来探讨前列地尔对大鼠局灶性脑缺血的防治机制及其量效关系。方 法：采用大脑中动脉闭塞方法建立局灶性脑缺血动物模型，观察低、中、高剂量前列地尔对局灶性脑缺血大鼠大脑皮质p53表达的影响。结 果：前列地尔各组大鼠脑组织p53表达平均灰度分别为115.75±11.38、140.13±11.38、156.21±10.05，均高于缺血对照组97.91±10.01。结 论：前列地尔防治大鼠局灶性脑缺血损伤的机制可能与抑制脑组织p53表达有关，且以高剂量效果较好 。
【关键词】 大鼠 脑缺血 前列地尔 P53
脑血管疾病是危害人类健康的常见病，其中缺血性脑损伤占有较大比例。因此，开发新型有效的脑缺血药物是目前研究热点。本研究试图通过给予大鼠不同剂量的前列地尔进行预适应，应用免疫组化法对凋亡相关基因p53进行测定，探讨前列地尔预适应的的脑神经保护机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
健康SD大鼠30只，雌雄各半，体重为200～250g，由锦州医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组、单纯缺血组、前列地尔低剂量组(1.25μg /kg)、前列地尔中剂量组(2.5μg /kg)和前列地尔高剂量组(5.0μg /kg)，每组6只大鼠。
1.2 药品及仪器
前列地尔脂肪乳剂(商品名:凯时)，由北京泰德制药有限公司提供，批号X262；兔抗大鼠P53由北京中杉金桥生物公司提供；仪器: S-3800全自动免疫组化染色仪(美国DAKO)；CIAS-1000型细胞图像分析系统(北京大恒图像视觉有限公司)。
1.3 给药方法
前列地尔脂肪乳剂用生理盐水配制成悬浮液。大鼠术前5天腹腔注射，1次/日，并于术前1h再次腹腔注射1次。
1.4 大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型的制备
以线栓法制作MCAO模型［1～2］。大鼠麻醉后，由右颈总动脉剪一小口，用直径0.235mm细线插入，以颈总动脉分叉处，进线深度为18±0.5mm，直至大脑中动脉起始部，以完全阻断血供。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。假手术组除不插入线栓外，其他步骤同上。
1.5 观测指标及检测方法
神经功能评分：MCAO术后24h处死大鼠，于处死前Longa等的5分制评分标准对各组大鼠进行评分：0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展左侧前爪；2分，向左侧旋转；3分，行走时向左侧倾倒；4分，不能自动行走，意识水平下降［3］。
免疫组化检测及图像分析：MCAO术后24h，将各组大鼠麻醉，灌流固定，断头取脑(大脑皮质及海马区)，梯度脱水，定向包埋，石蜡切片。免疫组化二步法染色。阳性表达主要定位在细胞核，呈棕黄色颗粒，部分细胞浆内也有淡染。每实验组随机选择5张切片,每张切片在缺血侧大脑皮层及海马区随机选择５个高倍视野，通过CIAS-1000型细胞图像分析系统检测阳性表达的平均灰度。灰度值越低，表示免疫组化染色越深，免疫反应性越强。
1.6 统计学分析
应用SPSS10.0软件分析，所有数据均用x±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析,P<0.05表示有显著差异。
2 结果
2.1 神经功能评分
与假手术组相比，缺血对照组出现明显的神经功能障碍(3.00 ± 0.63)，神经行为评分显著升高(P<0.05)；与缺血对照组比较，低、中、高剂量组的神经行为评分均明显降低分别为2.00±0.63、1.67±0.52、1.17±0.75vs3.00±0.63，P<0.05，前列地尔各剂量组大鼠行为功能缺陷均获不同程度改善，肌力表现明显增加，其中以高剂量组更为显著。见表1。
2.2 免疫组化结果
各组大鼠脑组织p53表达的平均灰度比较见表2。
表1 不同剂量前列地尔对MCAO大鼠神经功能的影响（略）
注：与缺血对照组比较, * P<0.05 ；与假手术组比较,# P<0.05；与前列地尔2.50μg/kg组比较,△ P<0.05。
表2 各组大鼠脑组织p53表达的平均灰度比较（略）
注：与缺血对照组比较, * P<0.05 ；与假手术组比较,# P<0.05；与前列地尔2.50μg/kg组比较,△ P<0.05。
3 讨论
p53是进化过程中高度保守的蛋白,其主要生物学功能为引起细胞阻滞,诱导凋亡和促进分化。人类p53蛋白存在两种形式即野生型(wtp53)和突变型(mtp53)。野生型p53为一个转录激活蛋白,作为"基因卫士"负责维持细胞基因的完整性、DNA损伤的修复和细胞周期的正常运转。当DNA受到各种基因毒剂损伤时,可诱导DNA受损细胞进入G1静止期,抑制细胞增殖,直到DNA损伤修复,如果修复失败, p53就激活那些诱导细胞凋亡的基因转录,使细胞进入凋亡状态。Rosenbaum等证实，大鼠局灶性脑缺血后缺血区的神经元p53表达增加，说明p53介导的凋亡参与了脑缺血的病理生过程［4］。凋亡是缺血性脑损伤后细胞死亡的重要形式。使用抗凋亡剂或采用相应对策可对神经细胞的损伤起到保护作用，这为缺血性脑损伤疾病的开辟了新途径。因此，大力开展抗缺血后神经细胞凋亡药物的研究是今后研究的方向之一。
前列地尔（PGE1）具有广泛的生物活性，可抑制血小板聚集、减少血栓素A2合成，激活血小板膜内腺苷酸环化酶，直接对抗血栓素A2释放所诱导的血管收缩与血栓形成［5］。国内外已广泛用于治疗血管性痴呆及周围血管病，临床效果较好，但有关机制还不十分清楚。本实验的结果初步证实在MCAO术前5天给予大鼠前列地尔，大鼠脑组织的p53的表达与缺血组比较呈不同程度的下降，且神经功能评分也显示大鼠的神经病学症状也较缺血组有明显的减轻，说明应用前列地尔预适应后对脑缺血确有保护作用，可能是通过抑制大鼠脑组织p53的表达从而抑制神经细胞的凋亡而发挥作用；同时还发现不同剂量前列地尔均可减轻大鼠脑缺血的损伤，3种剂量间差异显著(P<0.05)；而高剂量前列地尔对局灶性缺血性脑损伤的保护作用效果最佳。
【】
1 孟宜良.线栓法大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型研究现状．国外医学神经病学神经外分册,2002,29(2):113.
2 Craft TK, Glasper ER, Mc Cullough I, et a1.Social interaction improves experimental stroke outcome.Stroke,2005,36:2006～20l1.
3 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerbral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989,20(1): 84.
4 Rosenbaum DM, Gupta GD, Amore J, et a1.p53(CD95/APO-1) plays a role in the pathophysiology of focal cerebral ischemia.J Neuroscl Res,2000,61(6):686～692.
5 刘畅,陶贵周,李艳芹.前列地尔预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的心脏超微结构的保护作用.解剖科学进展,2004,10(2):133～135.
