超声处理对β?内酰胺类抗生素高分子杂质含量的影响

                           作者：任学毅，李绪伦，李宁，朱晓璐 

【摘要】  　　目的：考察超声前处理方法对β?内酰胺抗生素高分子杂质含量的影响。方法：采用葡聚糖凝胶（Sephadex）G?10高效液相色谱系统对不同厂家的注射用头孢曲松钠和阿莫西林胶囊进行分析。结果：采用超声前处理的方法可导致注射用头孢曲松钠和阿莫西林胶囊的高分子杂质含量出现不同程度的降低(5.5%～14.8%)。结论：检测β?内酰胺类抗生素的高分子杂质含量时应尽量避免强烈的超声处理。

【关键词】  超声处理 注射用头孢曲松钠 阿莫西林胶囊 高分子杂质 凝胶色谱
   
　　［Abstract］ Objective:To study the effects of ultrasonic treatment on determination of high?molecular weight impurities in β?lactam antibiotics. Methods: The content of high?molecular weight impurities in amoxicillin capsules and ceftriaxone sodium for injections had been determined by HPLC sephadex G?10 gel filtration chromatography. Results: The content of high?molecular weight impurities in amoxicillin capsules and ceftriaxone sodium for injections had been reduced in some degree by ultrasonic treatment (5.5%～14.8%). Conclusions: Ultrasonic operation should be avoided to the greatest extent while testing the determination of high?molecular weight impurities in β?lactam antibiotics.

　　［Key words］ Ultrasonic treatment; Ceftriaxone sodium for injections; Amoxicillin capsules; High?molecular weight impurities; Gel filtration chromatography
   
　　β?内酰胺类抗生素是临床上常用的药物之一，同时也是较易发生不良反应的药物之一，在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。有资料报道引发β?内酰胺类抗生素速发型过敏反应的过敏原并不是β?内酰胺类抗生素本身，而是其中存在的高分子聚合物［1］。因此，控制该类药物中高分子聚合物的含量，是减少由使用β?内酰胺类抗生素引发过敏反应的首要考虑。
   
　　药典2005年版已在β?内酰胺类抗生素11个品种的21个药品标准中规定了对高分子聚合物的检查要求［2］。但由于高分子聚合物杂质是一个极微量的含量测定目标，同时由于杂质结构本身存在不稳定、不均一和不确定的特性，因此在药品储运、使用以及检测过程中，高分子杂质含量一直处于动态变化中。我们按药典标准对多种β?内酰胺类抗生素高分子杂质进行检查时发现，在不同的实验条件下得到的杂质含量波动范围较大，而药典标准中对某些具体的实验条件并未予以明确规定，这给生产药品的厂家自检和执行法定检验的机构判定检验结果带来极大的困难，不利于控制该类药物中高分子聚合物的含量。超声是实验室常见的药品助溶手段，尤其是对含辅料的胶囊剂和颗粒剂。本实验通过比较超声处理助溶与振摇研磨处理助溶对β?内酰胺类抗生素高分子杂质检出量的影响，进一步阐明如何较为准确地检测出该类杂质的含量。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器
   
　　Agilent 1100 HPLC仪，1100四元泵系统，1100 VWD型紫外检测器，1100恒温自动进样器。色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）：管径10.0 mm，柱长300 mm，以葡聚糖凝胶（Sephadex）G?10为填充剂。超声波清洗器（KB2200B型，昆山市超声仪器有限公司），超声波清洗器参数：超声频率40 KHz，超声功率100 W，超声处理的能量3 106 W/m2。

　　1.2  试药与材料
   
　　注射用头孢曲松钠（重庆药友制药有限责任公司；规格：0.5 g/瓶；批号：060801、060802、060803）；注射用头孢曲松钠（四川制药制剂有限公司；规格：1.0 g/瓶；批号：070110、070111、070112）；阿莫西林胶囊（海南省金岛制药厂；规格：0.25 g/袋；批号：20070907、20070908、20070909）；阿莫西林胶囊（海南海灵制药厂有限公司；规格：0.25 g/袋；批号：070924、070925、070926）。头孢曲松对照品（中国药品生物制品检定所；含量：84.1%；批号：130480?200302）；青霉素对照品（中国药品生物制品检定所；含量：88.8%；批号：130437?200502）；蓝色葡聚糖2000（分析纯，Pharmacia公司）。

　　2  方法与结果

　　2.1  高效液相凝胶色谱法

　　2.1.1  色谱条件及系统适用性试验  参照中国药典2005年版相应品种项下的色谱条件。注射用头孢曲松钠以pH 7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液［0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液?0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液（61∶39）］为流动相A，阿莫西林胶囊以pH 8.0的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液［0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液?0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液（95∶5）］为流动相A，二者均以水为流动相B，流速均为1.0 mL/min，检测波长均为254 nm。理论塔板数按蓝色葡聚糖2 000峰计为1 900，拖尾因子均小于2.0，蓝色葡聚糖2 000峰、对照溶液峰和供试品溶液中聚合物杂质峰的保留时间均在11.5～11.7 min之间，头孢曲松对照品溶液峰面积RSD=0.65%，青霉素对照品溶液峰面积RSD=0.72%。

　　2.1.2  对照品溶液的配制  取头孢曲松对照品25 mg，精密称定，置250 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；取青霉素对照品20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

　　2.1.3  供试品溶液的配制  取注射用头孢曲松钠0.2 g两份，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，其中一份充分振摇助溶，另一份超声5 min助溶。取阿莫西林胶囊内容物两份，混合均匀，精密称取适量（约相当于阿莫西林200 mg），分别置10 mL量瓶中，其中一份研细，加2%碳酸钠溶液5 mL使溶解后，用水稀释至刻度，充分振摇助溶，滤过，另一份加2%碳酸钠溶液5 mL使溶解后，用水稀释至刻度，超声5 min助溶，滤过。
　　
　　2.2  样品测定和结果
   
　　分别立即取配制好的供试品溶液和对照品溶液各100 μL注入液相色谱仪，对照品溶液均以流动相B为流动相，供试品溶液分别以相应的流动相A为流动相，记录色谱图，按外标法，结果见图1～3和表1、表2。
   
　　由表1可见：超声处理使重庆药友公司的注射用头孢曲松钠高分子杂质含量降低了6%左右，四川制药制剂公司的该品种降低了14%左右。由表2可见：超声处理使海南金岛公司的阿莫西林胶囊高分子杂质含量降低了6%左右，海南海灵公司的该品种降低了8.5%左右。

　　3  讨论
   
　　由于超声处理破坏了抗生素高分子聚合物之间的次级键，使检测出的高分子聚合物杂质含量普遍有所降低，故进行样品检测时，样品的前处理（助溶）应尽量避免强烈的超声，尤其是对含辅料溶解性较差的胶囊剂等，应通过研磨及摇匀助溶。

　　图1  蓝色葡聚糖2000色谱图（略）

　　图2  注射用头孢曲松钠供试品色谱图（略）

　　图3  阿莫西林胶囊供试品色谱图（略）   

　　相同种类的样品若其检出杂质含量越低，超声处理的影响越明显。注射用头孢曲松钠杂质含量为0.6%左右时影响约为6%，杂质含量为0.2%左右时约为14%。阿莫西林胶囊也有相似的。可能的原因是β?内酰胺类抗生素中的高分子杂质按其来源通常分为外源性杂质和内源性杂质两类。外源性杂质包括蛋白、多肽、多糖等杂质，或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物，它一般来源于发酵工艺。内源性杂质系指抗生素药物自身聚合的产物，聚合物可来自生产过程，又可在储存过程中形成，甚至在用药时也可由于使用不当产生。超声处理一般只能破坏内源性杂质，即破坏抗生素药物自身聚合形成的高分子聚合物之间的次级键。杂质含量低的样品其内源性杂质可能居多，所以受超声处理的影响更明显。本文样品的超声处理时间均为5 min，延长超声时间未发现杂质含量进一步减少。注射用头孢曲松钠超声处理放置1 h内的重新聚合现象不明显，杂质含量变化甚微，但放置8h以后有明显的重新聚合现象发生，不同厂家和不同批号的样品杂质含量有不同程度的增加。

　　表1  注射用头孢曲松钠不同处理方法高分子杂质测定结果（略）

　　表2  阿莫西林胶囊不同处理方法高分子杂质测定结果（略）
   
　　影响β?内酰胺类抗生素高分子杂质检出量的因素还有很多方面。其他的具体检验条件，如溶液配制好后放置时间的长短、不同摩尔浓度的流动相A、不同的分离柱以及不同的实验仪器对最后检测出的杂质含量均有不同程度的影响。本实验选用Agilent 1100 HPLC仪和大连依利特公司的色谱柱，主要考虑的是Agilent 1100 HPLC仪的液相色谱工作站灵敏度高，对检测出的杂质峰面积积分较准确，新买的依利特色谱柱能保证色谱柱的分离能力和分离效果一致，这样得到的实验结果精密度较高、重复性较好。

【】
  　　［1］ 金少鸿， 胡昌勤. β?内酰胺类抗生素过敏反应研究进展［J］. 新药杂志, 1994, 3(4): 38.

　　［2］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）［S］. 2005年版. 北京: 化学出版社, 2005: 134?313.