血浆对红细胞 Cd55 分子表达影响的实验研究

                            作者：屠晓华 钱宝华 郭峰 花美仙 

【摘要】  目的：用与分离实验体系探讨血浆对红细胞 CD55 分子表达的影响。方法：采用免疫荧光标记流式细胞仪分析方法，分别将有抗原和无抗原组、有血浆和无血浆组 37℃ 孵育后，检测红细胞 CD55 分子平均荧光强度。结果：正常血浆对照组红细胞 CD55 分子平均荧光强度（6.49±1.03）明显高于无血浆对照组（5.66±1.16）（t = 2.408，P = 0.010），HBsAg 阳性血浆对照组（6.26±0.95）也高于无血浆对照组（t = 1.809，P = 0.039），但不如正常血浆对照组显著。S180 激活无血浆实验组红细胞 CD55 分子平均荧光强度（6.73±1.39）明显高于无血浆对照组（P < 0.01）。结论：正常血浆和 S180 抗原激活均对红细胞 CD55 分子表达有明显上调作用，而 HBsAg 携带者血浆对红细胞 CD55 分子表达上调作用较弱，血浆的调控机理有待深入研究。

【关键词】  血浆；S180；红细胞；CD55

    〔Abstract〕  Objective  To  research  the  effects  of  plasma  on  expression  of  erythrocyte  CD55  molecules  by means  of  natural  and  separative  experimental  system.  Methods  Antigen  group,  no  antigen  group,  plasma  group and  no  plasma  group  were  incubated  at  37℃.  Then  the  mean  fluorescence  intensity  of  erythrocyte  CD55 molecules  was  detected  using  flow  cytometry  assay.    Results     The  mean  fluorescence  intensity  of  erythrocyte CD55  molecules  in  normal  plasma  control  group  (6.49±1.03)  was  much  higher  than  that  in  no  plasma  control group  (5.66±1.16)  (t = 2.408,  P = 0.010).  The  mean  fluorescence  intensity  of  erythrocyte  CD55  molecules  in HBsAg  positive  plasma  control  group  (6.26±0.95)  was  also  higher  than  that  in  no  plasma  control  group  (t = 1.809,  P = 0.039),  but  not  so  significantly.  The  mean  fluorescence  intensity  of  erythrocyte  CD55  molecules  in  S180  activated  no  plasma  experimental  group  (6.73±1.39)  is  significantly  higher  than  that  in  no  plasma  control  group (P  <  0.01) .  Conclusion   Both  normal  plasma  and  S180  antigen  can  significantly  up-regulate  expression  of erythrocyte  CD55  molecules,  while  the  same  action  of  HBsAg  carrier's  plasma  is  weaker.  The  mechanism  of  how  plasma  acts  as  the  role  is  still  to  be  researched  more  deeply.

    〔Key  Words〕    Plasma;  S180;  Erythrocyte;  CD 55

     红细胞天然免疫主干道理论认为红细胞多种天然免疫分子在系统血液免疫反应中具有重要意义，而系统血液免疫反应过程中有 4 种要素决定了血液免疫反应的程度与状态：①抗原种类；②血浆状态；③红细胞天然免疫功能状态；④白细胞免疫功能状态。而血浆状态不同可影响红细胞免疫分子的表达，从而影响整个血液免疫反应状态[1]。本文作者利用系统免疫学自然与分离体系比较实验，发现血浆和抗原对红细胞 CD 55 分子表达有明显促进作用。现将有关资料报道如下。

    1    材料与方法

    1.1    材料

    正常人 ACD（acid citrate dextrose）抗凝新鲜全血、HBsAg 携带者血浆各 20 例由人民解放军上海血站提供。S180 癌细胞悬液（1~2×106/mL）由第二军医大学长海输血科免疫室提供。鼠抗人CD55-FITC 荧光单克隆抗体（美国 BD pharmingen 公司），流式细胞仪（BD FACS Calibur, USA）。

    1.2    方法

    1.2.1    预备实验    新鲜采集的健康人 ACD 抗凝全血 5 mL，室温下 2 500 r/min，离心 5 min，分离上层血浆备用。将剩余压积全血细胞以生理盐水洗涤 3 次后，用生理盐水恢复至原体积，混匀即为全血细胞悬液备用。取 ELISA 法检测 HBsAg 阳性血液 5 mL，室温下 2 500 r/min，离心 5 min，分离上层血浆备用。

    1.2.2    正式实验    分 6 个反应组别在试管中分别加入相应的成分：

    正常血浆实验组：0.2 mL S180 癌细胞悬液 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL 自身血浆。

    正常血浆对照组：0.2 mL 生理盐水 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL 自身血浆。

    无血浆实验组：0.2 mL S180 癌细胞悬液 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL 生理盐水。

    无血浆对照组：0.2 mL 生理盐水+ 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL 生理盐水。

    HBsAg 阳性血浆实验组：0.2 mL S180 癌细胞悬液 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL HBsAg 阳性血浆。

    HBsAg 阳性血浆对照组：0.2 mL S180 生理盐水 + 0.2 mL 全血细胞悬液 + 0.3 mL HBsAg 阳性血浆。

    将上述试管混匀后置于 37℃ 恒温水浴箱中孵育 1 h，期间每隔 15 min 摇匀 1 次，使反应充分进行；取出试管以 2 500 r/min，离心 5 min，弃去上清液，压积全血细胞用生理盐水洗涤 1 次后待测。

    1.2.3    取待测全血细胞 1   L，以 50   L PBS 缓冲液（pH7.2）稀释，加 CD55-FITC 单抗 4   L，充分混匀后室温避光保存 20 min；再加入 2 mL PBS 液，1 000 r/min，离心 5 min，弃去上清液，加入 300   L PBS，立即上流式细胞仪检测 CD 55 平均荧光强度。

    1.3    统计学处理

    实验数据以 x±s 表示，统计学处理采用 t 检验。

    2    结    果

    用 20 例正常人全血细胞悬液加入自身血浆或HBsAg 阳性血浆，与不加血浆组比较，发现正常血浆对照组红细胞 CD55 分子表达量明显高于无血浆对照组（t = 2.408，P = 0.010），而 HBsAg 阳性血浆对照组红细胞 CD55 分子表达量也高于无血浆对照组（t = 1.809，P = 0.039），但低于正常血浆对照组。S180 激活的各实验组红细胞 CD55 分子表达量总体都高于相应的对照组，其中无血浆实验组红细胞 CD55 分子表达量明显高于无血浆对照组（P < 0.01）。详见表 1。

    3    讨    论

    红细胞上 CD 55 分子又被称为衰变加速因子（DAF），具有促进 C3 转化酶衰变的活性。除膜结合型 CD55 分子外，血浆中还存在可溶性 CD55 分子，其主要生物学作用是抑制补体的活化，保护红细胞免遭补体介导的溶解破坏[2]。另外，还发现CD55 分子可有效防止补体过度活化[3]，以及在协助红细胞 CD35（CR1）转运补体调理的抗原抗体复合物中起着重要的作用[4]。CD55 分子含有 GPI 锚结构，可参与细胞间黏附及信号传递作用，参与 B 淋巴细胞免疫调控[5，6]。

    笔者研究发现正常人血浆的存在可明显上调红细胞 CD55 分子表达量，可能与血浆中的可溶性CD55 分子与红细胞膜结合型 CD55 分子处于动态平衡有关；HBsAg 阳性血浆增强正常人红细胞 CD55 分子表达的能力低于正常人血浆，可能与可溶性 CD55 分子含量不同有关，说明 HBsAg 携带者的红细胞免疫调控能力可能存在一定程度的下降，这为临床辅助诊断开辟了新的途径。

    本研究还发现 S180 抗原激活可导致红细胞CD55 分子表达量的上升，而且在无血浆组这种上调作用更为显著，可能说明外来抗原可直接激活红细胞 CD55 分子表达，而血浆中有关物质可缓冲这种激活作用，其机制有待深入研究。

    本研究采用体外仿真实验方法说明了血浆中的有关物质及外来抗原可影响和增强红细胞 CD55 分子的表达，今后需进一步探讨其发生机制与在临床上存在的辅助诊断价值[7]。

【】
  〔1〕郭峰. 红细胞天然免疫主干道理论与系统免疫学〔J〕. 杂志, 2006, 28(2):79-83

〔2〕Morgan J. Spendlove I Oumant LG. The role of CD55 in protecting the tumour environment from complement attack〔J〕. Tissue Antigen, 2002, 60(3):213-217

〔3〕郭峰, 钱宝华, 张乐之. 现代红细胞免疫学〔M〕. 上海:第二军医大学出版社, 2002. 21-24

〔4〕Craig ML, Waitumbi JN, Taylor RP. Processing of C3b-opsonized immune complexes bound to non-complement receptor 1(CR1) sites on red cells: phagocytosis, transfer, and associations with CR1〔J〕. J Immunol, 2005, 174(5): 3059-3066

〔5〕Nicholson W, Wang CE. Structure and function of decay accelerating factor CD55〔J〕. J Lab clin Med, 1994, 123(4): 485-489

〔6〕郭峰, 张乐之, 钱宝华, 等. 血细胞天然免疫分子CD55、CD59与体液免疫相关性分析〔J〕. 深圳中西医结合杂志, 2005, 15(1):15-16

〔7〕郭峰, 程灵芝, 钱宝华, 等. 血细胞天然免疫分子CD55与免疫球蛋白相关性分析〔J〕. 深圳中西医结合杂志, 2005, 15(1):19-20